[發(fā)明專利]一種高效表達脂肪酸的重組藍藻及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810573421.1
• 申請日: 2018-06-06
• 公開（公告）號: CN108753809B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 馬鋼;莎加·阿夫林;王毓舒;賀林
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P7/40;C12P7/64;C12N9/16;C12N9/10;C12R1/01
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種高效表達脂肪酸的重組藍藻及其制備方法，涉及脂肪酸生產領域。通過構建提高藍藻脂肪酸表達量的質粒并轉化獲得重組藍藻，該重組藍藻過表達前脂蛋白二脂酰轉移酶Lgt和硫酯酶AcTesA。前脂蛋白二脂酰轉移酶Lgt是一種支架蛋白，在藍藻膜導向序列的作用下定位于細胞膜。硫酯酶AcTesA通過柔性肽FL3與支架蛋白Lgt相連，硫酯酶蛋白AcTesA具有低底物特異性，可以水解C8－C16的酰基ACP，能獲得種類豐富的脂肪酸產物。本發(fā)明通過支架蛋白Lgt將硫酯酶蛋白AcTesA的固定在細胞膜上，加快了藍藻細胞中脂肪酸合成速度，降低了細胞中的ROS含量，最終提高了轉基因突變株分泌至細胞外的脂肪酸產量。

技術領域

本發(fā)明涉及一種重組藍藻，尤其涉及其在提高藍藻脂肪酸合成效率方面的作用及其制備方法。

背景技術

能源，是整個人類社會發(fā)展的推動力，隨著石油資源的緊缺以及環(huán)境的日亦惡化，對環(huán)保且可再生能源的需求變得越來越迫切，而生物燃料能很好地解決此問題。脂肪酸是合成生物燃料的重要前體，可以通過化學或生物合成將其進一步加工成脂肪醇、脂肪烴、脂肪酸甲酯等不同用途的化工材料和能源。目前為止，被用于生產脂肪酸的微生物主要是大腸桿菌和酵母，但天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂產量有限，且天然脂肪酸多為胞內分泌，必須從組織和細胞中分離才能得到，增加了生物燃料的制造成本。

作為一種原始的單細胞原核生物，藍藻廣泛分布在不同的生境中，能利用太陽能進行產氧性光合作用。與植物和異養(yǎng)微生物相比，藍藻具有光合轉化效率高、生長速度快、不占用土地、遺傳操作簡便等優(yōu)勢，而且經過遺傳改造的藍藻能夠將合成的燃料物質直接分泌出胞外，有助于降低工藝成本，因此在生物燃料開發(fā)領域具有廣闊的應用前景。利用代謝工程和合成生物學手段對藍藻脂肪酸代謝途徑進行改造和調控以提高目的產物產量的工作有很多。研究人員用藍藻模式菌株Synechocystis sp.PCC 6803作為宿主細胞，通過敲除內源酰基-ACP合成酶(AAS)，過表達乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)，引入經密碼子優(yōu)化的大腸桿菌硫酯酶(TesA)，同時削弱細胞壁肽聚糖層的強度，將游離脂肪酸產量提高到了197mg/L。在另一種脂肪酸耐受的藍藻模式菌株Synechococcus sp.PCC 7002中，研究人員也通過敲除酰基-ACP合成酶(AAS)和長鏈脂肪酸輔酶A連接酶(FadD)，以及過表達大腸桿菌硫酯酶TesA和來源于Synechococcus elongatus PCC 7942的RuBisCO基因，最終合成了130mg/L的游離脂肪酸。在發(fā)明專利“一種脂肪酸產量提高的重組藍藻、其制備方法及其應用”中，發(fā)明人通過在Synechocystis sp.PCC 6803中過表達乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)，將重組藍藻的總脂肪酸含量相較于野生型藻株提高了47.93％。

但是，要想達到工業(yè)生產的需求，目前用藍藻來生產脂肪酸的效率還遠遠不夠，需要更有效的方法對脂肪酸代謝途徑進行改造，以獲得理想的產物合成效率。在構建脂肪酸合成工程菌的過程中，研究人員不僅要解決在不影響宿主細胞體內代謝流平衡的前提下最大限度地提高脂肪酸生物合成途徑的效率的問題，同時還要面對工程菌對于其自身代謝終產物耐受性不足的挑戰(zhàn)。研究表明，藍藻對脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸具有較高的敏感性，不飽和酸可能通過與活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)反應產生一些毒性物質，如過氧化氫物或自由基，這些物質會通過插入細胞或細胞器膜對細胞生理活動產生影響。有研究顯示，ROS的產生和胞內游離脂肪酸的含量密切相關，因此對脂肪酸的耐受性不足是限制工程化藍藻的經濟穩(wěn)定性的重要因素之一。另外，由于很多工程菌都會被敲除酰基－ACP合成酶(AAS)來阻斷脂肪酸的再循環(huán)途徑，因此進一步加劇了脂肪酸在胞內的堆積，給細胞生長造成巨大的壓力。不少研究工作通過削弱細胞外膜強度和過表達脂肪酸外排泵系統來促進積聚在胞內的游離脂肪酸外排，進而提升胞外游離脂肪酸的產量，但是類似的改造會對細胞產生生長抑制效應，造成細胞的提早凋亡，因此現有技術并不利于構建穩(wěn)定的脂肪酸合成工廠。