[發明專利]一種難溶性脂肽的純化制備方法

在審

• 申請號: 201810561853.0
• 申請日: 2018-06-04
• 公開（公告）號: CN108707182A
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 秦敬國;任麗萍;徐海紅;徐紅巖
• 申請（專利權）人: 江蘇吉泰肽業科技有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 張勁風

本發明提供了一種難溶性脂肽的純化方法，主要解決目前的純化方法中粗產品難溶，收率低的問題。本發明技術方案是：先用氨水溶液加熱溶解樣品，提高脂肽的溶解性。然后以高效液相色譜法純化，采用聚合物色譜柱以堿性溶劑為流動相，有效提高了產品的收率。以C4色譜柱做二次純化并同時轉鹽，減少了一步純化過程。并有效降低有機溶劑的使用量，縮短時間，達到成本低，收率高的目的，同時適用于工業化放大生產。

技術領域

本發明屬于多肽純化領域，具體涉及一種脂肽的純化方法。

技術背景

美容肽或美容勝肽,是屬于降解的小分子膠原蛋白，含氨基酸基團，一般由2-10個氨基酸組成。勝肽也是人體中原本就存在的成分，是一種由氨基酸組成的鏈狀結構。我們所熟悉的蛋白質，就是一種多勝肽鏈。勝肽的生物學活性取決于其氨基酸組成和序列，人體內各種生理進程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質調控的。因此，生物活性肽成為了化妝品研發和應用的全新方向和思路，并且功能越來越細分，如：抗衰老、抗過敏、修復、抗氧化、抗水腫、促進毛發再生、抑制黑色素生成、豐胸、減肥等。

脂肽（棕櫚酰六肽）即為美容肽的一種，是一種屬于Matrikine系列的信號肽，特別與修復年齡相關性皮膚損傷有關。在彈力蛋白的整個分子結構中六肽VGVAPG片段重復了六次之多，因此被稱作“spring fragment”。 棕櫚酰六肽具有趨化作用，可以促進真皮成纖維細胞遷移、增殖和基質大分子合成（如彈力蛋白，膠原蛋白等）,為皮膚提供支撐。同時它還可以誘導成纖維細胞和單核細胞到特定的位置以達到傷口修復和組織更新。棕櫚酰六肽具有類似能抑制神經傳導物質，阻斷神經肌肉間的傳導功能，避免肌肉過度收縮，就能防止細紋形成,能夠減緩肌肉收縮的力量，讓肌肉放松，減少動態紋的發生與消除細紋；有效重新組織膠原彈力，可以增加彈力蛋白的活性，使臉部線條放松，皺紋撫平改善松弛。可用于化妝品內，作為抗皺成分，且效果極佳。

因此這條脂肽在美容品中得到了廣泛的應用，但因這條多肽的氨基酸都是疏水性的，同時含有一個溶解性很差的棕櫚酸，使其溶解性很差，造成目前常規的純化方式存在收率低，成本高的缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種低成本、高收率、適合產業的難溶性脂肽的純化方法，主要解決目前的純化方法中粗產品難溶，收率低的問題。

本發明的技術方案為：一種難溶性脂肽的純化制備方法，包括以下步驟：

（1）將脂肽粗品溶于氨水中，放于水浴鍋中加熱攪拌直至溶液呈澄清狀態，冷卻，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液；

（2）用反相高效液相色譜法進行純化，填料為反相聚合物色譜柱，流動相A為質量百分比為0.05%~0.1%的碳酸氫銨水溶液，流動相B為純乙腈溶液，梯度洗脫，流動相梯度為A:B由（60~40）:（40~60）到（40~20）:（60~80），收集主峰；

（3）用反相高效液相色譜法進行二次純化同時轉鹽，填料為C4反相硅膠柱，流動相C為體積百分比為1~5%的冰醋酸水溶液，流動相D為體積百分比為1~5%的冰醋酸乙腈溶液，梯度洗脫，流動相梯度為C:D由（50~40）:（50~60）到（30~20）:（70~80），收集檢測合格后的主峰，減壓蒸餾，冷凍干燥，得到純度大于98%以上的脂肽。

上述步驟（1）中，氨水的濃度為質量百分比10%，粗品的溶解濃度為20mg/ml~40mg/ml，優選為30mg/ml，粗品的溶解需要水浴加熱攪拌，溫度為35~45℃，優選40℃；

上述步驟（2）中，填料為PS/DVB基質的反相聚合物填料，粒徑為10-15μm，優選10μm，流動相A優選質量百分比為0.1%的碳酸氫銨水溶液，流動相梯度為A:B優選為60:40到40:60；