[發(fā)明專利]分離白蛋白非結(jié)合物、白蛋白結(jié)合物和小分子化合物的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810561518.0
• 申請(qǐng)日: 2018-06-04
• 公開（公告）號(hào): CN108840922A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜旭召;龐田;白茜茜;李云峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北常山生化藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/605
• 分類號(hào): C07K14/605;C07K14/62;C07K1/20
• 代理公司: 石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 13100
• 代理人: 齊蘭君

本發(fā)明公開了一種分離白蛋白非結(jié)合物、白蛋白結(jié)合物和小分子化合物的方法，包括如下步驟：用洗脫液平衡色譜柱后，將含有白蛋白結(jié)合物和非結(jié)合的小分子化合物混合溶液上樣至色譜柱；用洗脫液沖洗色譜柱，當(dāng)色譜柱中流出液體的UV吸光度達(dá)到10mAU時(shí)開始收集含白蛋白結(jié)合物的沖洗液，當(dāng)UV吸光度降至基線水平時(shí)停止收集；用純化水沖洗色譜柱，當(dāng)含游離的小分子化合溶液的UV吸光度達(dá)到10mAU時(shí)開始收集含游離小分子化合物的沖洗液，當(dāng)UV吸光度降至基線水平時(shí)停止收集。從含有白蛋白結(jié)合物與非結(jié)合白蛋白的溶液中分離游離小分子化合物，具有分離效果好，處理批量大的優(yōu)點(diǎn)。解決了不能去除游離小分子化合物的缺點(diǎn)，克服了采用凝膠過濾層析方法處理批量小的缺陷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于從含有白蛋白非結(jié)合物及白蛋白結(jié)合物溶液中分離白蛋白非結(jié)合物及白蛋白結(jié)合物和游離小分子化合物的方法。

背景技術(shù)

白蛋白本身具有可生物降解、無毒、無抗原性、病人耐受和生物利用度高等特點(diǎn)，因此白蛋白受到生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。其中白蛋白載藥技術(shù)應(yīng)用比較廣泛和成熟，白蛋白載藥體系可改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，如延長藥物半衰期，增強(qiáng)藥物活性等。目前，已有多個(gè)藥物采用相關(guān)技術(shù)上市，比如白蛋白納米紫杉醇，索瑪魯肽等。

Conjuchem公司的藥物親和構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)技術(shù)也是一種采用白蛋白偶聯(lián)藥物的技術(shù)平臺(tái)，該平臺(tái)是對(duì)母體藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后與白蛋白的34位半胱氨酸殘基（巰基）反應(yīng)，由于并不是所有的白蛋白分子都含有34位半胱氨酸殘基（巰基），因此在白蛋白和修飾后的小分子化合物耦合后需要去除未反應(yīng)的游離白蛋白。CN1956998A 描述了純化白蛋白結(jié)合物的方法，具體為一種用于通過疏水作用層析從含有白蛋白結(jié)合物與非結(jié)合白蛋白的溶液中分離白蛋白結(jié)合物的方法。CN1956998A具體是將含有白蛋白結(jié)合物與非結(jié)合白蛋白的溶液加樣到用高含鹽量的水性緩沖液平衡的疏水性填料上，通過降低鹽的濃度梯度洗脫實(shí)現(xiàn)把含有白蛋白結(jié)合物與非結(jié)合白蛋白分離。

在白蛋白和小分子化合物結(jié)合反應(yīng)后，除含有非結(jié)合白蛋白外，還會(huì)含有非結(jié)合的游離小分子化合物。CN1956998A只是有效地把白蛋白結(jié)合物和非結(jié)合物進(jìn)行了分離，并不能把未反應(yīng)的游離的小分子化合物去除。在含有小分子化合物的白蛋白溶液中，白蛋白的分子量是小分子化合物分子量的十幾倍，因此本專業(yè)人員在分離小分子化合物時(shí)通常會(huì)根據(jù)分子量的較大差異，采用凝膠過濾層析的方法進(jìn)行純化，比如GE公司的superdex75或superdex200填料，采用凝膠過濾層析的方法雖然可以實(shí)現(xiàn)有效分離，但該采用該技術(shù)的缺點(diǎn)是上樣量小，處理批量小。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種用于從含有白蛋白非結(jié)合物及白蛋白結(jié)合物的溶液中將白蛋白非結(jié)合物及白蛋白結(jié)合物與非結(jié)合的小分子化合物分離的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，這種分離白蛋白非結(jié)合物、白蛋白結(jié)合物和小分子化合物的方法，其特征在于包括如下步驟：

a. 用洗脫液平衡苯基瓊脂糖凝膠色譜柱后，將含有白蛋白結(jié)合物和非結(jié)合的小分子化合物混合溶液上樣至苯基瓊脂糖凝膠色譜柱；

b. 用洗脫液持續(xù)沖洗苯基瓊脂糖凝膠色譜柱，當(dāng)色譜柱中流出液體的UV吸光度達(dá)到10mAU時(shí)開始收集含白蛋白結(jié)合物的沖洗液，當(dāng)色譜柱中流出液體的UV吸光度降至基線水平時(shí)停止收集；

c. 停止收集白蛋白結(jié)合物后，再用純化水持續(xù)沖洗苯基瓊脂糖凝膠色譜柱，當(dāng)含游離的小分子化合溶液的UV吸光度達(dá)到10mAU時(shí)開始收集含游離小分子化合物的沖洗液，當(dāng)含游離小分子化合物溶液的UV吸光度降至基線水平時(shí)停止收集。

所述洗脫液由磷酸鈉、硫酸銨、辛酸鈉組成，所述洗脫液pH值為6.0，所述磷酸鈉、硫酸銨、辛酸鈉之間的摩爾比為20:1～10:5。

所述小分子化合物為GLP-1類似物或胰島素。