[發明專利]一種基于DNA增強孔雀石綠熒光的快速檢測法及其應用

在審

• 申請號: 201810551422.6
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108715847A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 郭亞輝;沈福苗;郝晗彤;錢和;成玉梁;于航;謝云飛;姚衛蓉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基于DNA增強孔雀石綠熒光的快速檢測法及其應用，屬于漁藥殘留(水產)檢測領域。本發明解決了現有的檢測方法測定流程復雜、前處理困難、耗時長、成本高的問題。本檢測方法主要包括如下步驟：a、在緩沖溶液中依次加入DNA，待測水溶液，劇烈混勻后，室溫靜置一段時間；b、使用熒光光譜儀在630nm激發光波長下進行熒光強度測定；c、測定不同濃度孔雀石綠標準水溶液的熒光強度，制作標準曲線，計算待測水溶液中孔雀石綠濃度。與現有的檢測方法相比，本發明通過DNA的G四聯體結構來增加孔雀石綠的剛性以此來增加其自身的熒光強度，建立了一種快速、簡便、高效的養殖水體中孔雀石綠的定性定量快速檢測方法，可應用于養殖水體中孔雀石綠的快速檢測。

技術領域

本發明涉及一種基于DNA增強孔雀石綠熒光的快速檢測法及其應用，屬于漁藥殘留(水 產)檢測領域。

背景技術

孔雀石綠(MG)是一種三苯甲烷類染料，由于其殺菌效果好，且價格低廉，很多養殖者 會在養殖過程中濫用孔雀石綠這種違禁藥物。經研究發現，孔雀石綠進入水生動物體內后， 會快速代謝成脂溶性的無色孔雀石綠，孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用。

目前，測定孔雀石綠的主要方法是色譜分析方法，包括高效液相色譜法、液相色譜一質 譜聯用法，還有酶聯免疫吸附(ELISA)法，電化學法等檢測方法，但這些方法測定流程復雜、 耗時長、成本高。而且孔雀石綠本身熒光強度很小，不能直接使用熒光光譜儀進行檢測。

發明內容

針對現有的孔雀石綠檢測方法所存在的上述問題，本發明提出了一種利用單鏈DNA來 增強孔雀石綠的熒光強度的快速檢測方法。本發明利用在Na⁺或K⁺存在下，單鏈DNA能夠 形成G四聯體結構，與孔雀石綠結合從而增加孔雀石綠結構的剛性使得孔雀石綠的熒光強度 大大增強，從大量理論上能形成G四聯體結構的DNA中篩選得到了能夠顯著增強孔雀石綠 的熒光強度的DNA，并建立了孔雀石綠的熒光強度的快速檢測方法。

本發明的第一個目的是提供一種能夠增強孔雀石綠的熒光強度的DNA，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示。

本發明的第二個目的是提供一種增強孔雀石綠的熒光強度的方法，所述方法是將核苷酸 序列如SEQ ID NO:11所示的DNA與含有孔雀石綠的樣品進行混合。

本發明的第三個目的是提供一種孔雀石綠的檢測方法，包括利用本發明的核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示的DNA。

在一些實施方式中，所述方法包括：將核苷酸序列如SEQ ID NO:11的DNA與含有孔雀 石綠的待測樣品進行混合，進行熒光強度的測定。

在一些實施方式中，所述方法還包括：將核苷酸序列如SEQ ID NO:11的DNA與不同標 準濃度的孔雀石綠的標準樣品進行混合，并測定熒光強度，繪制熒光強度與雀石綠濃度對應 關系的標準曲線。

在一些實施方式中，所述方法還包括：將待測樣品中檢測到的熒光強度代入到標準曲線 中，從而獲知待測樣品中孔雀石綠的濃度。

在一些實施方式中，所述熒光強度的測定，是使用熒光光譜儀在630nm激發光波長下 進行熒光強度測定。

在一些實施方式中，所述將DNA與含有孔雀石綠的待測樣品進行混合具體是：在緩沖 液中添加DNA和待測樣品，混合，靜置。

在一些實施方式中，所述緩沖溶液可以是一下任意一種或者多種：磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH＝6.6)，Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L K⁺)，Tris-HCl緩沖 液(0.05mol/L，pH＝6.5，100mmol/L Na⁺)。

在一些實施方式中，所述緩沖液與DNA、待測樣品的體積比為：170:10:20。