[發明專利]一種B型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810551390.X
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108676815A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 郭筱璐
• 申請（專利權）人: 深圳市免疫基因治療研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/17;A61P7/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種B型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，其中，所述慢病毒載體還包括FIX基因。本申請改造后的慢病毒載體的基礎上特異地連入FIX基因，能夠在保障安全性的同時實現更高效的基因傳遞，使得FIX基因在骨髓相關細胞中的表達量明顯增加，能夠更高效的完成B型血友病基因治療過程中正常基因的傳遞。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種B型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，尤其涉及一種應用改良后的慢病毒載體優化表達FIX基因用于制備治療B型血友病的藥物。

背景技術

B型血友病(Hemophilia B)是一種由于機體FIX基因突變造成的FIX缺失或功能不全引起的機體凝血功能障礙的出血性疾病。B型血友病患者的血漿中FIX活性低于正常水平的40％，并且根據血漿中該因子的活性將疾病分為三種類型：嚴重(<1％)，中度(1％-5％)，輕度(5％-50％)。該病患者活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長，終身具有輕微創傷后出血傾向，重癥患者沒有明顯外傷也可發生“自發性”出血。新生男性嬰兒中血友病B型的發生率為1:25,000，并無種族和地域特異性。

目前主要是依靠補充功能正常的FIX蛋白來進行替代治療(Replacementtherapy)，主要使用人血中提取或重組純化的FIX蛋白。然而該蛋白的來源血液制劑存在人免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒等病原污染的可能，雖然隨著基因工程方法應用于因子的合成及純化，感染傳染病的風險被大大降低，但是病人持續性的替代治療醫療費用十分高昂，并且需要終生治療，生活質量低下。事實上，只要患者血漿中凝血因子活性少量增加(≥正常水平的2％)就可以顯著改善病癥，這使得基因治療方法成為根治該病的一種可能，為B型血友病患者帶來全新的希望。

CN 101351229公開了一種裝載FIX基因的猴免疫缺陷病毒(SIV)載體治療劑，用該治療劑感染臍帶血干細胞之后將細胞移植入NOD/SCID小鼠體內，觀察到了超過60天的FIX持續性表達。也有較多醫用腺病毒相關病毒(Adeno associated virus，AAV)載體攜帶肝臟特異性啟動的FIX蛋白進行小鼠的基因治療，結果顯示小鼠體內能夠有一定量的FIX蛋白表達，并能夠達到治療劑量，但是并不能實現該基因長期有效的在體內進行表達。此外AAV載體免疫原性較高，人類接觸AAV并對其產生抗體反應的概率很高，在很大的程度上限制了AAV在基因治療領域的應用。

因此，如何選用一種免疫原性更低，并且能夠實現長期有效的基因表達的載體，并且其基因傳遞效率高的同時又能具有良好的安全性能是實現B型血友病基因治療的重要保障。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種B型血友病慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用，所述B型血友病慢病毒載體轉染效率更高，穩定性更強，安全性更好。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種慢病毒載體，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，具體改造方式如下：

(a)其5’端的剪接供體位點被刪除或改造，改造后的慢病毒載體剪接供體位點不是所述包裝載體和所述參照慢病毒之間的同源重組的潛在位點；

(b)其仍具有病毒包裝信號功能；

其中，所述慢病毒載體還包括FIX基因。