[發明專利]一種免疫細胞的分離方法及其應用

在審

• 申請號: 201810541480.0
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108795862A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 徐智峰;張新
• 申請（專利權）人: 廣州沙艾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K35/14
• 代理公司: 北京華識知識產權代理有限公司 11530
• 代理人: 劉艷玲

1.一種免疫細胞分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.在25℃環境中，外周血樣本和培養基按2-4:1比例稀釋，并緩慢充分混勻，得到培養基和外周血混合的血液稀釋液；

S2.以上步驟的血液稀釋液和淋巴細胞分離液按1:2-6比例稀釋，混合液加入離心管中，確保混合液形成明顯分層，上層為血液稀釋液，下層為淋巴細胞分離液；

S3.4℃低溫離心，第1-10min，1000rpm，上下加速度均為0；第11-30min，2000rpm，上下加速度均為0；

S4.離心結束后，離心管中液體明顯分層，從上到下依次為血漿與培養基混合液層、單個核細胞白膜層、人淋巴細胞分離液層及紅細胞層，用移液器小心吸取白膜層置于新的離心管，盡量不要吸到其他層，補充培養基，并用移液器輕輕混勻；

S5.4℃低溫離心，第1-15min，1000rpm，上下加速度均為9；第16-30min，1500rpm，上下加速度均為9；

S6.去除上清液，保留細胞沉淀，補充等量培養基，并用移液器輕輕混勻，離心洗滌細胞，4℃低溫離心，800rpm，1min，上下加速度均為9；

S7.重復步驟S6兩次；

S8.去除上清液，補充等量的培養基，輕輕充分打勻后，用精確10ul量程的移液器吸取10ul細胞懸液，置于一250ul的離心管，隨之在管中加入臺盤藍10ul，用移液器充分混勻，臺盼藍染色5min，取10ul細胞懸液均速沖池入血細胞計數板，倒置相差顯微鏡10倍目鏡下計數；分別計數四大格未染成藍色的細胞總數和染成藍色的細胞總數。

2.根據權利要求1所述的免疫細胞分離方法，其特征在于，步驟S8所述的細胞計數中，所述免疫細胞總數和存活率計算按以下公式：

X＝(N/4)*v*2*n*10⁴；

V＝(X-Y)/X*100％；

其中：X：細胞總數；Y：染成藍色細胞數；N：四大格細胞總數；n：細胞懸液稀釋倍數；v：細胞懸液總體積；V：細胞存活率。

3.根據權利要求1所述的免疫細胞分離方法，其特征在于，所述培養基成分包括1640培養基、NaHC0₃、胎牛血清，頭孢菌素、L-谷氨酰胺，人類重組細胞因子，IL-2、TNF。

4.根據權利要求3所述的免疫細胞分離方法，其特征在于，所述培養基中1640培養基的體積百分比為95-98％，NaHC0₃的濃度為3mg/mL～10mg/mL，胎牛血清的體積百分比為1％-10％，青霉素的濃度為20ng/mL～50ng/mL；L-谷氨酰胺的濃度為3-20ng/mL；人類重組細胞因子15ng/mL～50ng/mL；IL-2的濃度為15ng/mL～50ng/mL；TNF的濃度為10ng/mL～30ng/mL。

5.通過權利要求1所述的方法分離得到的免疫細胞在制備DC疫苗中的應用。