[發(fā)明專利]用于核苷酸序列修飾的組合物、方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810535575.1
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108707635B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 李大力;張曉輝;朱碧云;劉明耀;席在喜
• 申請（專利權）人: 華東師范大學;上海邦耀生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/63;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李青

本發(fā)明公開了用于核苷酸序列修飾的組合物、方法與應用，涉及基因編輯技術領域。該組合物包括第一載體和第二載體,第一載體包括5’?3’的式(I)結構:P_II?X1?L1?X2?PolyA；第二載體包括5’?3’的式(II)結構：P_III?Y1?P_II?Y2?L2?Y3或Y4或Y5?L3?Y4?PolyA；該組合物可對靶序列上的更寬的位置上的堿基進行修飾，具有較廣闊的核苷酸修飾空間。

技術領域

本發(fā)明涉及基因編輯技術領域，具體而言，涉及一種用于核苷酸序列修飾的組合物、方法與應用。

背景技術

自2013年以來，以CRISPR/Cas9為代表的新一代基因編輯技術進入生物學領域的各個實驗，正改變著傳統(tǒng)的基因操作手段。

利用CRISPR/Cas9技術與胞嘧啶脫氨酶或者腺苷脫氨酶融合而成的單堿基基因編輯技術，分別可實現(xiàn)基因組上定點的C/G到T/A(簡稱CBE)，A/T到G/C(簡稱ABE)單堿基的突變。單堿基基因編輯技術，是基于Cas9n(D10A)與胞嘧啶脫氨酶或者腺苷脫氨酶融合而成，因此，其除了依賴Cas9識別PAM(例如NGG)外，存在一個“工作窗口”。若spCas9n融合，則它的工作窗口則是距離PAM遠端數(shù)起4-9位，且在5-7位比較高效地實現(xiàn)基因編輯；若saCas9n融合，則它的工作窗口則是距離PAM遠端數(shù)起4-12位，且在10-12位比較高效地實現(xiàn)基因編輯。因此，其工作窗口也影響了在基因組上的可編輯的空間，極大的限制了單堿基基因編輯系統(tǒng)應用范圍。

因此，本領域迫切需要一種具備較廣的工作窗口的單堿基基因組編輯系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于核苷酸序列修飾的組合物，采用該組合物可以對核苷酸序列進行修飾，且具有較廣的修飾區(qū)域，可以對PAM序列上游的第3-16位區(qū)域更廣范圍內(nèi)的核苷酸進行修飾，具有較廣的應用前景。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述組合物在在基因突變、基因修復、構建有基因突變導致的疾病動物模型、基因治療、基因功能篩選、藥物篩選或疾病診斷等領域中的應用。采用本發(fā)明的組合物，可以針對感興趣的基因組的目標區(qū)域進行修飾。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種修飾核苷酸序列的方法，采用該用該方法可以對PAM序列上游的第3-16位區(qū)域范圍的核苷酸核進行修飾，具有較廣的核苷酸修飾區(qū)域和更廣泛的的應用前景。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種用于核苷酸序列修飾的組合物，其其包括：第一載體和第二載體；

其中，所述第一載體包括5’-3’的式(I)結構：

P_II-X1-L1-X2-PolyA 式(I)；

式(I)中，P_II為II型啟動子；X1為突變型Cas9(D10A)核酸酶的編碼序列；X2為多肽表位的編碼序列，L1為無或連接序列；各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列；

其中，所述第二載體包括5’-3’的式(II)結構：

P_III-Y1-P_II-Y2-L2-Y3或Y4或Y5-L3-Y6-PolyA 式(II)；

式(II)中，P_III為III型啟動子；Y1為sgRNA的骨架序列；P_II為II型啟動子；Y2為多肽表位的單鏈抗體結合域的編碼序列；L2為無或連接序列；Y3為胞嘧啶脫氨酶與尿嘧啶糖苷酶抑制劑融合編碼序列；Y4為野生型腺苷脫氨酶與突變型腺苷脫氨酶融合編碼序列；Y5為Y3與Y4融合編碼序列；L3為自剪接多肽2A；Y6為篩選標記蛋白表達序列；各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列。