[發明專利]一種提高CIK細胞活性的培養方法

在審

• 申請號: 201810485928.1
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108642011A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 王歡
• 申請（專利權）人: 王歡
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種提高CIK細胞活性的培養方法。本發明發現，表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內酯A、苦蘵內酯F和魏察苦蘵素A可以激活CIK細胞中顆粒酶B的表達，為有效的顆粒酶B激活劑；顆粒酶B激活劑表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內酯A、苦蘵內酯F和魏察苦蘵素A可以顯著提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。本發明還提供了制備表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內酯A、苦蘵內酯F和魏察苦蘵素A的方法，該方法不依賴于反復柱層析，適用于工業化大規模制備。現有技術沒有公開過本發明公開的技術方案。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及CIK細胞的培養及誘導化合物的制備方法。

背景技術

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，目前常規的手術和放化療治療方法均不能徹底清除體內的瘤細胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優點成為重要的腫瘤輔助治療手段。其中，細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkiller cells，CIK細胞)是近年來發現的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優點，已經成為腫瘤免疫治療領域的一種新選擇。CIK是以CD3+CD56+T細胞為主的異質細胞群，兼有NK細胞和T細胞的特征。在功能上，CIK一方面擁有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有NK細胞非MHC限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微。CIK細胞的增殖和細胞毒活性依賴于多種外源性細胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經成為抗腫瘤的過繼免疫細胞生物治療的一個熱點(參考文獻：黃招琴等，卡介菌多糖核酸對CIK細胞活性的影響，湖南師范大學自然科學學報，2017年3月第40卷第2期)。

顆粒酶B是殺傷性T淋巴細胞和NK細胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，通過Caspases依賴途徑、直接入核途徑及不依賴Caspases的胞質途徑殺傷靶細胞，顆粒酶B的表達水平直接關系到CIK細胞對腫瘤的殺傷力(參考文獻：Prakash MD,Bird CH,BirdPI.Active and zymogen forms of granzyme B are constitutively released fromcytotoxic lymphocytes in the absence oftarget cell engagement,Immunol CellBiol.2009)。

因此，如果能尋找到促進CIK細胞顆粒酶B表達水平的誘導化合物，就可以用于CIK細胞培養提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。

表原莪術烯醇(CAS登錄號127214-97-5)、莪術烯醇(CAS登錄號19431-84-6)、苦蘵內酯A(CAS登錄號146713-98-6)、苦蘵內酯F和魏察苦蘵素A(CAS登錄號120824-03-5)的化學信息如圖1所示。目前沒有現有技術道過表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內酯A、苦蘵內酯F和魏察苦蘵素A可以存進CIK細胞顆粒酶B的表達。

另外，目前制備表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內酯A、苦蘵內酯F、魏察苦蘵素A的方法步驟復雜，依賴于反復柱層析，不適用于規模化制備。

發明內容

本發明的目的在于提供一種CIK細胞的培養方法。

本發明通過下面的技術方案得以實現的：

一種CIK細胞的培養方法，包括：

取外周抗凝血100mL，加入淋巴細胞分離液，1500rpm離心15min，吸取單個核細胞層，用生理鹽水洗滌3次，每次1500rpm離心10min；最后一次離心后重懸細胞，按細胞數5×10⁶個/mL加含有500μg/L CD3mAB、1000U/mL IL-2和10％FBS的GT-T551培養基誘導培養成CIK細胞，每隔2～3d半量換液。