[發明專利]基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及應用

在審

• 申請號: 201810480921.0
• 申請日: 2018-05-18
• 公開（公告）號: CN108642090A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 高利利
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 鄒成嬌

本發明涉及一種基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo?B敲除模式小鼠的方法及應用，獲得Nogo?B敲除模式小鼠的方法包括步驟：設計高效的識別特定基因EGE?ZXH?007的sgRNA；將sgRNA連入質粒載體上，然后進行體外轉錄，得到可進行顯微注射的Cas9/sgRNA；將可進行顯微注射的Cas9/sgRNA顯微注射到小鼠受精卵中，然后對出生的小鼠進行基因型檢測和鑒定，確認最終得到Nogo?B敲除模式小鼠。本發明采用CRISPR/Case9技術制備Nogo?B敲除模式小鼠，與傳統基因敲除技術相比，更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變，為進一步研究Nogo?B的功能打下良好的基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及應用。

背景技術

基因敲除是針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。

基因敲除技術是20世紀80年代發展起來的，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎干細胞技術基礎上的一種新分子生物學技術。基因同源重組技術是指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。胚胎干細胞是從著床前胚胎(孕3-5天)分離出的內細胞團細胞，它具有向各種組織細胞分化的多分化潛能，能在體外培養并保留發育的全能性，在體外進行遺傳操作后，將它重新植回小鼠子宮，它能發育成胚胎的各種組織。

基因敲除動物模型是在活體動物上開展基因功能研究的重要工具。但是傳統的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、胚胎干細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術的要求很高，而且費用大，耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統技術構建基因敲除小鼠一般也需要一年以上。

Nogo-B是網狀蛋白家族4的重要成員，廣泛表達于中樞神經系統及外周組織，其亞細胞定位于細胞內質網及細胞膜，Nogo-B主要參與血管損傷、組織修復、再生及炎癥過程的調控，并可能在腫瘤細胞凋亡中也發揮重要作用。因此構建Nogo-B敲除模式小鼠，對于深入研究Nogo-B在多種疾病中的作用機制有重要的意義。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明目的在于提供一種基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及應用，構建方法易于操作，效率高，更容易得到純合子突變，為進一步研究Nogo-B的功能打下良好的基礎。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案為：

本發明提供了一種基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法，包括步驟：設計高效的識別特定基因EGE-ZXH-007的sgRNA；將sgRNA連入質粒載體上，然后進行體外轉錄，得到可進行顯微注射的Cas9/sgRNA；將可進行顯微注射的Cas9/sgRNA顯微注射到小鼠受精卵中，然后對出生的小鼠進行基因型檢測和鑒定，確認最終得到Nogo-B敲除模式小鼠。

優選地，基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

優選地，基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，質粒載體為帶T7啟動子的質粒載體。

優選地，基于CRISPR/Cas9技術獲得Nogo-B敲除模式小鼠的方法中，在將sgRNA連入質粒載體上之前，還包括Cas9/sgRNA構建和活性檢測的步驟。