[發(fā)明專利]人類脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因缺失檢測的熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810480117.2
• 申請日: 2018-05-18
• 公開（公告）號: CN108642172A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方月;曾驥孟;龔劍;唐乃平;蒙明慧
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇醫(yī)諾萬細胞診療有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 淮安市科文知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 32223
• 代理人: 謝觀素

本發(fā)明公開一種人類脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因缺失檢測的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒采用Taqman探針的熒光定量PCR法。該試劑盒分別設(shè)計了SMN1基因第7和第8外顯子，以及內(nèi)參基因RPP40的特異性引物和探針。本試劑盒可以直觀、準確、快速地對SMN1基因的第7和第8外顯子進行檢測，從而實現(xiàn)SMA正常人和患者的區(qū)分，作為人類脊髓性肌萎縮癥的輔助診斷，適合推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子檢測領(lǐng)域，是一種用于檢測人類脊髓性肌萎縮癥SMN1基因第7和第8外顯子缺失檢測的引物探針組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy, SMA）是常見的染色體隱性遺傳病，脊髓前角細胞變性導(dǎo)致肌無力和肌萎縮，臨床表現(xiàn)為進行性、對稱性的四肢和軀干肌肉無力、萎縮，患者最終死于呼吸衰竭和肺部感染，居致死性常染色體遺傳病第二位。該病在新生嬰兒中的發(fā)病率約1/6000至1/10000，正常人群的攜帶率約1/40至1/50。根據(jù)患者的發(fā)病年齡和病情癥狀將SMA分為急性嬰兒型（Ⅰ型）、慢性嬰兒型（Ⅱ型）、少年型（Ⅲ型）、成人型（Ⅳ型）。Ⅰ型是SMA中最嚴重的一種，通常在出生后6個月內(nèi)發(fā)病，患兒不能獨坐和站立，多數(shù)患兒在2歲前死亡。Ⅱ型患兒中等嚴重程度，出生后6~18個月內(nèi)發(fā)病，患兒能獨坐，但不能獨自站立和行走，其生命一般在2年以上。Ⅲ型患者是慢性SMA，病情較輕，一般18歲內(nèi)發(fā)病，可以獨立行走，但比健康兒童晚且不能跑，可存活至成年。Ⅳ型患者的發(fā)病年齡約37歲，病情較輕，基本不影響生存。

研究發(fā)現(xiàn)，該病的主要致病基因是運動神經(jīng)元存活基因1（survival motorneuron, SMN1），定位于5號染色體長臂1區(qū)3帶。SMN基因在全身組織中普遍表達，大部分細胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角細胞（脊髓運動神經(jīng)元）無法耐受低水平的SMN蛋白。90%~95%的SMA患者存在SMN1基因的純合缺失，5%~10%的患者存在SMN1基因的復(fù)合雜合突變，即一條染色體上的SMN1基因缺失，另一條染色體上的SMN1基因存在點突變。人類基因組存在一個和SMN1高度同源的SMN2基因，兩者的外顯子只存在兩個堿基的差異，分別是7號外顯子上的C/T和8號外顯子上的G/A。SMN1基因的缺失與SMA的臨床表型的嚴重性不相關(guān)，SMN2基因的缺失不造成SMA表型，但其拷貝數(shù)的對少與SMA表型的輕重呈負相關(guān)，即SMN2的拷貝數(shù)越多，產(chǎn)生的功能SMN蛋白也越多，病情自然越輕。SMN1基因點突變的類型和分布與SMA的臨床表型嚴重程度密切相關(guān)，突變類型有錯義突變、移碼突變、無義突變和剪接位點突變等。

SMA的常規(guī)輔助檢查包括肌電圖、肌酸磷酸激酶、肌肉活檢等，但是SMA的臨床變異性大，肌電圖在兒童患者易出現(xiàn)不配合檢查，活檢為有創(chuàng)檢查，缺乏特異性易出現(xiàn)誤診。基因診斷能夠無創(chuàng)檢測致病基因SMN1基因的改變，可以作為SMA很好的輔助診斷。該研究項目即可以適用于SMN1基因純合缺失，也適用于SMN1基因雜合缺失及檢測SMN1基因部分的點突變。因此，該項目可以較廣泛地用于不同類型SMA的診斷，且操作簡便、特異性強，適用于SMA患者的輔助診斷。雖然大部分患者是由于SMN1基因純合缺失，但是仍有一部分SMA患者是由于SMN1基因復(fù)合雜合突變所致。目前，用于SMA基因檢測的方法有限制性片段長度多態(tài)性、實時定量PCR、變性高效液相色譜技術(shù)、MLPA、Sanger測序等，這些方法多數(shù)只用于純合缺失的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于人類脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因缺失檢測的引物探針組、試劑盒及方法，該基因缺失為SMN1基因第7和第8外顯子缺失突變。

本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種用于人類脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因缺失檢測的引物探針組，其特征在于，所述的人類脊髓性肌萎縮癥相關(guān)基因缺失為人類脊髓性肌萎縮癥SMN1基因第7和第8外顯子缺失，該引物探針組包括3對引物和3條探針，所述的3對引物分別為：