[發明專利]肺癌ALK基因重排快速檢測熒光探針及制備方法

在審

• 申請號: 201810473715.7
• 申請日: 2018-05-17
• 公開（公告）號: CN108690878A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 周勇;黃崴
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，具體涉及肺癌相關基因快速檢測技術領域。本發明所獲得的非小細胞肺癌ALK基因重排快速檢測熒光探針，我們設計的探針不含有重復序列，避免非特異性交叉反應，具有準確性高，特異性好及假陽性低的優點。利用本發明所述的快速熒光原位雜交液，將雜交時間由原來的16h縮短到2h，大大提高了診斷效率。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及肺癌相關基因快速檢測技術領域。

背景技術

隨著現代醫學的發展以及治療理念的更新，腫瘤的治療已經由傳統的手術以及放化療逐漸向個性化的分子靶標治療轉變，而尋找一個特異并且有效的治療靶點，是當前腫瘤治療研究的熱點之一。棘皮動物微管相關樣蛋白4（Echinoderm microtubuleassociated protein-like4.EML4與漸變性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma Kinase,ALK）融合基因是非小細胞肺癌（NSCLC）中繼表皮生長因子受體（EGFR）突變，Kras（ras 基因家族中的一種）突變后的又一特異性腫瘤驅動基因的分子靶向位點。EML4和ALK基因均定為于2號染色體的短臂，分別位于P21帶和P23帶，由于兩者的分布方向相反，故發生融合時，其中一者需要從染色體上斷裂，從而調轉方向，與另一者發生融合。由于EML4斷裂位點多變，所以與ALK發生融合可以形成多種不同的亞型。目前已經發現的EML4-ALK融合基因亞型至少有11種，其中部分亞型與腫瘤的發生密切相關。這些融合位點包括EML4編碼蛋白質N端的基因片段和ALK激酶，激活下游信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、分化、抗凋亡。到目前為止除EML4基因外，已知還有TGF、KIF5B等多種基因可與ALK基因發生融合，啟動ALK基因的表達，從而驅動致癌。靶向藥物克唑替尼可以通過抑制ALK基因從而發揮遏制腫瘤生長的作用，是第一個針對漸變性淋巴瘤激酶（ALK）進行靶向治療的藥物，用于治療通過FDA批準的檢測方法診斷為ALK陽性的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌患者。2011年8月美國食品藥品管理局（FDA）批準克唑替尼用于臨床治療NSCLC.

熒光原位雜交技術是基于放射性原位雜交的一種非放射性分子細胞遺傳技術，熒光標記取代了同位素。因為ALK 基因重排包括大的染色體片段插入和易位，所以選擇熒光原位雜交方法來檢測所有類型的ALK基因重排。該方法可以通過探針特異性標記細胞核中的ALK斷裂點來檢測ALK重排，進而鑒別出EML4-ALK。相對于THC和RT-PCR,FISH具有高敏感性和高特異性的優勢。目前FISH是美國食品和藥物管理局唯一批準的在應用克唑替尼前檢測ALK基因的重排的方法，是檢測EML4-ALK融合基因的金標準.

目前市場上已有的肺癌ALK基因重排的檢測試劑盒，但是需要雜交試劑過長，通常在16h以上，影響診斷效率。

發明內容

本發明提供一種肺癌ALK基因重排快速檢測熒光探針的制備方法及一種快速熒光原位雜交液的配方。通過所述探針制備方法得到兩組熒光探針分別位于ALK基因的3’端的兩側，而此位置是ALK基因重排發生的活性位點，不僅能夠與TGF,EML4,KIF5B等多種基因發生重排。而且也能夠預測和檢測尚未知的其他與ALK基因發生重排的基因，從而影響ALK基因的表達引發的致癌檢測。該方法，配方操作簡單，特異性和靈敏性高，可以快速，準確地檢測出肺癌融合基因，檢測結果準確且可靠，同時可以為醫生對肺癌進行分子分型提供參考依據，適用于大規模推廣應用.

為實現上述目的本發明采用以下技術方案：

一種肺癌ALK基因重排快速檢測熒光探針，其特征在于，所述熒光探針是雙色分離探針，兩組熒光探針分別位于ALK基因的3’的兩端.

如權利要求1所訴一種肺癌ALK基因重排快速檢測熒光探針，其特征在于，所述熒光為紅，綠兩種探針，ALK基因位于2號染色體短臂2區3帶的位置，其基因長度為728.838Kb，采用ALK基因3’端上游300Kb基因紅色熒光標記，ALK基因3’端下游420Kb采用綠色熒光標記.