[發(fā)明專利]Ogura CMS不育恢復(fù)基因RfoB

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810468233.2
• 申請(qǐng)日: 2018-05-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108642061B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋洪元;杜楊梅;徐冰冰;李勤菲;任雪松;司軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 康海燕

1.Ogura CMS不育恢復(fù)基因Rfo^B，其特征在于，其核苷酸序列是根據(jù)結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capita）密碼子偏好性對(duì)蘿卜（Raphanus sativus）Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)不育Rfo恢復(fù)位點(diǎn)的Rfo基因編碼區(qū)cDNA序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化而成，所述蘿卜Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)不育Rfo基因編碼區(qū)cDNA序列如SEQ ID No.1所示；所述Ogura CMS不育恢復(fù)基因Rfo^B的ORF（開(kāi)放性閱讀框）具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述恢復(fù)基因Rfo^B基因自起始密碼子 (ATG) 上游起第103位處插入有來(lái)自馬鈴薯（Solanum tuberosum）ST-LS1基因的一段內(nèi)含子序列，所述ST-LS1基因的一段內(nèi)含子序列如SEQ ID No.3所示；所述恢復(fù)基因Rfo^B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.權(quán)利要求1所述的Ogura CMS不育恢復(fù)基因Rfo^B在制備Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系中的應(yīng)用。

3.表達(dá)如權(quán)利要求1所述的Ogura CMS不育恢復(fù)基因Rfo^B的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述植物表達(dá)載體含有Rfo^B表達(dá)元件，Rfo^B表達(dá)元件中的啟動(dòng)子是PRfo，PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.如權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述Rfo^B表達(dá)元件中的終止子為E9-t，E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

5.如權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述Rfo^B表達(dá)元件的下游插入有篩選標(biāo)記基因表達(dá)元件，所述篩選標(biāo)記基因是BAR基因（除草劑草丁膦抗性基因）。

6.如權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述篩選標(biāo)記基因表達(dá)元件中的啟動(dòng)子為CaMV35S。

7.權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的植物表達(dá)載體在制備Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的Ogura CMS不育恢復(fù)基因Rfo^B在制備Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系中的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）人工合成恢復(fù)基因Rfo^B序列，并將Rfo^B序列克隆于PUC57 (GenBank: Y14837.1)質(zhì)粒上；

（2）提取甘藍(lán)型油菜Ogura CMS 恢復(fù)系ougRR-271基因組DNA，采用引物對(duì)pRfo-F和pRfo-R，以ougRR-271基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得啟動(dòng)子PRfo片段，將獲得PRfo的克隆于PBluescripte SK質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，PRfo的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，pRfo-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，pRfo-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

（3）提取豌豆基因組DNA，采用引物對(duì)E9-F和E9-R，以豌豆基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得終止子E9-t，將獲得的E9-t克隆于PBluescripte SK質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，E9-t的核苷酸序列如SEQ ID No.6，E9-F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，E9-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

（4）以植物表達(dá)載體pCA1300BAR為基礎(chǔ)進(jìn)行改建，改建包括以下步驟：

步驟①，將克隆驗(yàn)證的E9-t終止子序列從PBluescripte SK質(zhì)粒上用EcoRI+BamHI雙酶切下后替換pCA1300BAR中的Nos終止子；

步驟②：將合成的Rfo^B基因用NcoI+BamHI切下插入步驟①獲得的載體的NcoI和BamHI位點(diǎn)之間；

步驟③：將克隆到的PRfo啟動(dòng)子用HindIII+NcoI切下替換步驟②獲得的載體中的雙35S啟動(dòng)子，獲得最終的植物表達(dá)載體PRfo：：Rfo^B-E9_t；

（5）構(gòu)建的植物表達(dá)載體PRfo：：Rfo^B-E9_t轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，將含PRfo：：Rfo^B-E9_t農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染化蕓薹屬Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)不育系的外植體，轉(zhuǎn)化后的外植體經(jīng)篩選培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，即為蕓薹屬Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系；

所述植物表達(dá)載體pCA1300BAR的核苷酸序列為SEQ ID No.11，所述植物表達(dá)載體PRfo：：Rfo^B-E9_t中的Rfo^B基因表達(dá)盒如SEQ ID No.12所示。