[發明專利]一種雙殼貝類精子質量檢測的方法

在審

• 申請號: 201810465708.2
• 申請日: 2018-05-16
• 公開（公告）號: CN108693101A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 王昭萍;杜俊鵬;于瑞海;馬培振
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 劉艷青

本發明提供了一種雙殼貝類精子質量檢測方法，該方法結合熒光染料雙染與流式細胞術來檢測雙殼貝類精子質量，包括如下步驟：首先調整精液濃度，然后以透膜的熒光染料及不透膜的熒光染料與待測精液進行染色，室溫孵育，流式細胞術檢測，得出檢測結果，所述透膜的熒光染料能夠與線粒體膜結合，不透膜的熒光染料可以穿過破損的細胞膜，并與胞內的核酸特異性結合。本發明通過一次檢測可同時獲得多個參數結果，不僅能夠清晰地區分不同狀態的精子并顯示其比例，得出精子死亡率、存活率、質膜受損率以及具線粒體活性比例，還可以避免主觀因素造成的精確率較低的現象，確保檢測結果的準確性。

技術領域

本發明涉及一種雙殼貝類精子質量檢測方法，尤其涉及一種精子受到脅迫之后，檢測精子存活率、質膜完整性及線粒體活性的方法及應用。

背景技術

目前，雙殼貝類精子質量檢測方法均為鏡檢。將精子置于光學顯微鏡下，觀察精子的運動時間、運動比例及運動的激烈程度。但是，由于每個人的經驗和判斷標準不同，再加上觀察精子存活的時間間隔太長，這類方法往往具有較大的主觀性和不準確性，易對實驗的精確性造成影響，容易得出錯誤結論。計算機輔助精子分析系統（CASA）的應用，使精子質量的研究得到較大改善，通過對精子運動軌跡、速度及動態參數的分析，從而鑒定精子的質量。CASA雖然能夠對精子密度和活力等參數進行測定，但是其具有一定的局限性，不能檢測精子內部結構的變化，尤其是經冷凍保存或者受脅迫的精子，因其質膜完整性和線粒體活性易受到損傷，對精子的質量影響顯著。在貝類精子質量的研究中，對精子進行兩種熒光染料染色使精子釋放不同顏色的熒光，然后在熒光顯微鏡下隨機計數，統計精子的存活率，此類方法雖然能夠檢測精子內部結構的變化，但是存在較大誤差，且費時費力。

因此，現在迫切需要一種精確的精子質量檢測方法，既能夠提高實驗的精確性，又能夠方便、快捷、客觀地檢測精子質量。

發明內容

為了避免傳統上鏡檢精子質量的主觀性、不準確性以及不精確性等缺點，本發明提供一種新型的雙殼貝類精子質量檢測的方法。

PI是一種膜不透性染料，能夠進入質膜破損或死亡的細胞內，并釋放熒光，常用PI檢測細胞質膜的完整性；Rh123是一種陽離子，可以透過質膜與線粒體特異性結合，具有跨膜電位的線粒體能夠釋放綠色熒光，由于Rh123無毒性，不影響細胞的代謝，所以Rh123常用來檢測線粒體活性。故本發明結合Rh123/PI雙染與流式細胞術來檢測精子質膜受損情況和線粒體活性，并準確測定精子的存活比例，在不損傷精子的情況下，方便快捷地區分各個狀態的精子，進而客觀準確地評價精子質量。

為達到上述目的，結合上述原理，本發明采取的具體技術方案為：

一種雙殼貝類精子質量檢測的方法，包括以下步驟：

（1）精液制取：解剖鏡檢，選擇性腺發育好的雄性個體，用吸管吸取精子置于滅菌海水中；

（2）熒光染液配制：將PI和Rh123分別溶于超純水中，儲存；

（3）精液染色：取一定量精液，加入兩種上述熒光染液混合，放置、離心，洗滌，重懸，再進行流式細胞儀檢測；

（4）流式細胞儀檢測結果：經PI/Rh123染色和FCM檢測的精子分布在不同的象限：R1表示質膜破壞線粒體無活性的死精子，R2表示質膜破裂但線粒體仍具有活性，也就是即將死亡的精子，R3表示質膜正常但無線粒體跨膜電位的精子，R4為正常的活精子。

進一步的，所述步驟（1）中，使用血球計數板調整精子濃度為10⁷~10⁸個/mL。

進一步的，所述步驟（2）具體為：將PI和Rh123分別溶于超純水中，均配成濃度為1mg/mL的儲存液，按照試劑儲存要求，分別放于-20℃和-4℃保存。