[發(fā)明專利]一種生殖道感染的純凈RNA靶標(biāo)實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810454023.8
• 申請(qǐng)日: 2018-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN108546745A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 一零零二信息科技（滄州）有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844
• 代理公司: 北京華旭智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11583
• 代理人: 馮云

本發(fā)明提供了一種生殖道感染的純凈RNA靶標(biāo)實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法，使用反轉(zhuǎn)錄酶、RNA多聚酶和優(yōu)化探針同時(shí)實(shí)現(xiàn)，包括如下步驟：(1?1)提取純凈的細(xì)胞靶核酸，即RNA作為靶標(biāo)后，采用M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶作為反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)生靶標(biāo)核酸RNA的一個(gè)DNA拷貝；(1?2)采用T7 RNA多聚酶作為RNA多聚酶，從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)RNA拷貝；(1?3)將帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和所提取的所述純凈的細(xì)胞靶核酸，即RNA拷貝特異結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，所述熒光信號(hào)由檢測儀器捕獲，根據(jù)實(shí)時(shí)獲得的所述熒光信號(hào)的出現(xiàn)時(shí)間和強(qiáng)度得到生殖道感染的檢測結(jié)果。該方法有效節(jié)約了醫(yī)療資源，并給患者帶來便利，檢測成本低，作為最新診斷技術(shù)快速、靈敏、特異、簡便，極大降低漏檢、誤檢率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢測和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及生殖道感染的純凈RNA靶標(biāo)實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測方法。

背景技術(shù)

生殖道細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括，細(xì)胞生物學(xué)方法(直接鏡檢，分離培養(yǎng))，免疫學(xué)方法(直接熒光抗體檢測，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))和分子生物學(xué)方法。

分子生物學(xué)方法現(xiàn)有技術(shù)通常采用的是實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)(Simultaneous Amplification and Testing，簡稱SAT)，該技術(shù)是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有高靈敏度、高特異性、低污染和反應(yīng)穩(wěn)定。

關(guān)于國外生殖道細(xì)菌感染的檢測技術(shù)，歐美疾控部門和WHO都推薦，分子診斷法作為檢測的一種手段，是目前最為靈敏準(zhǔn)確的方法。而且，只有分子診斷法可以檢測尿液，因?yàn)椴蓸臃奖悖浅＿m用于普遍篩查。在美國，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(TMA)以64％的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)成為主流的檢測技術(shù)。國外研究表明，該技術(shù)不受標(biāo)本取材的影響，取樣方便，靈敏度高，特異性好，同時(shí)還可以用于用藥情況的監(jiān)測和判愈。對(duì)于醫(yī)院而言，可提高其整體的診療水平，對(duì)病人而言，則避免了反復(fù)就診，可降低診治成本。國外市場是Gen-Probe公司的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，擴(kuò)增并檢測生殖道細(xì)菌rRNA。優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)感染細(xì)胞中有大量的rRNA，而且操作步驟簡便，只是一個(gè)恒溫過程，不需要變換溫度的擴(kuò)增儀。由于檢測方法是終點(diǎn)檢測，容易導(dǎo)致環(huán)境污染，國內(nèi)尚無采用該法進(jìn)行檢測的報(bào)道。目前國內(nèi)對(duì)生殖道細(xì)菌的檢測主要為膠體金和PCR。但培養(yǎng)的不易，膠體金檢測結(jié)果的不佳，PCR的污染問題，也引發(fā)了臨床對(duì)RNA檢測的期盼。醫(yī)院常規(guī)CT樣本為尿道拭子和宮頸拭子(部分為陰道拭子)，需要專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行樣本采集，對(duì)男性患者而言，采集樣本過程痛苦。恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒是唯一獲得SFDA批準(zhǔn)的，可用于檢測尿液樣本的診斷試劑，靈敏度高，特異性好，并因擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA，可避免DNA引起的臨床污染，然而其采樣仍然屬于侵入型，患者比較痛苦。

RNA檢測技術(shù)不僅可以檢測尿道和宮頸拭子，而且可以檢測尿液標(biāo)本。以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，以PCR法為擴(kuò)大金標(biāo)準(zhǔn)采用SAT檢測男女生殖道標(biāo)本的CT，拭子標(biāo)本的靈敏度97.0％，特異性99.1％、準(zhǔn)確度98.6％；首次排空尿液樣本的靈敏度95.8％、特異性99.1％、準(zhǔn)確度98.3％。尿液標(biāo)本的選擇，可減輕患者痛苦，減少醫(yī)務(wù)人員工作量。sanger測序是目前所有基因檢測的國際金標(biāo)準(zhǔn)！sanger測序是目前所有基因檢測的國際金標(biāo)準(zhǔn)，是包括熒光定量PCR Taqman探針法、普通PCR法、芯片法、二代測序法、質(zhì)譜法等方法的金標(biāo)準(zhǔn)?？蒲蓄I(lǐng)域發(fā)表基因檢測相關(guān)文章，必須要有sanger測序驗(yàn)證數(shù)據(jù)予以支持。sanger測序之所以是目前基因檢測的國際金標(biāo)準(zhǔn)，是因?yàn)閟anger測序原理非?？茖W(xué)，過程非常縝密，結(jié)果真實(shí)可視，準(zhǔn)確率非常高，達(dá)到99.999％。不需要建庫，屬于直接測序，直接讀取結(jié)果，連續(xù)讀取數(shù)據(jù)(不是一個(gè)點(diǎn))，不需要推導(dǎo)結(jié)論，過程明朗數(shù)據(jù)支撐充分。這項(xiàng)技術(shù)是雖然經(jīng)過了38年，但應(yīng)用仍然廣泛，還是測序的主力軍，好多檢測其他方法不能替代。

由于RNA核酸檢測技術(shù)的高靈敏度和特異性，在具備分子生物學(xué)條件的實(shí)驗(yàn)室，可以采用該方法常規(guī)檢測應(yīng)用，然而，如何以純凈的RNA作為靶標(biāo)進(jìn)行生殖道感染的實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測現(xiàn)有技術(shù)中并沒有記載，實(shí)踐中也沒有規(guī)范成熟的技術(shù)，屬于醫(yī)療界的一大難題。