[發明專利]一種假結核耶爾森氏菌抗真菌蛋白及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201810451848.4
• 申請日: 2018-05-12
• 公開（公告）號: CN108486085B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 沈錫輝;潘君風;宋莉;楊昶杏;徐磊;張磊;王瑤
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;A01N47/44;A01P3/00;A23L3/3526
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

本發明公開了一種假結核耶爾森氏菌抗真菌蛋白及其編碼基因和應用，屬于基因工程技術領域，所述抗真菌蛋白為由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中經取代、缺失或插入一個或幾個氨基酸序列所獲得的具有同等活性的蛋白質。本發明還提供了所述抗真菌蛋白的編碼基因、表達載體、工程菌，本發明還提供了類假結核耶爾森菌抗真菌蛋白的分離純化方法。所述蛋白在抗真菌藥劑中的應用以及所述蛋白的編碼基因在轉化植物中的應用。本發明涉及的YPK_AFP1001抗真菌基因及蛋白具有更高，更廣譜的抗真菌活性。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種假結核耶爾森氏菌抗真菌蛋白及其編碼基因和應用，具體地說，涉及來源于假結核耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的抗真菌蛋白YPK_AFP1001、其生產和應用方法以及編碼抗真菌蛋白的DNA序列。

背景技術

病原真菌對農作物具有造成破壞性的損害，并對會對牲畜和人類產生不利的健康后果(Wang et al。2003；Yevtushenko et al。2005；Corrado et al。2008)；每年真菌感染直接造成五大糧食農作物水稻、小麥、玉米、土豆和大豆的產量損失達1.25億噸。真菌感染糧食農作物的疾病主要包括：稻瘟病、小麥桿銹病、玉米黑穗病、土豆晚疫病和大豆銹病等作物疾病。現今，植物疾病的防治主要依靠化學農藥，但是農藥的使用受到了嚴格的監管和控制，并且會對環境造成不可逆的破壞。而抗真菌基因或抗真菌蛋白則被認為實踐中用于作物水果及蔬菜生物防治的新手段，特別是轉抗真菌基因的應用具有很好的應用前景。

生物體通過產生抗真菌蛋白(AFP)，抗真菌肽或化合物來防治真菌侵襲。抗真菌蛋白是先天性免疫反應中的進化保守組件，并且是主要的效應分子。抗真菌蛋白參與生物體的組成抗性或者誘導抗性機制，使生物體能夠有效地抵抗致病真菌的侵害(Claude P.S.(2001)Antifungal Proteins[J].Applied And Environment Microbiology67(7):2883-2894)。

一般來說，肽由50個或更少的氨基酸殘基組成，分子量較小，而蛋白質則含有更多的氨基酸殘基，分子量則更大。抗真菌蛋白基因引入農作物后，可以顯著增強其對致病真菌的抗性(Wong等，2010)。研究者已經從許多種動植物、真菌及細菌中分離出來抗真菌蛋白和抗真菌肽(植物：Wang et al。2001；Wel and Loeve 1972；Ye et al。，2001a，b，動物：Wangand Ng 2002b；Lee et al，1995，細菌：Bormann et al 1999和真菌Gun Lee等1999)。根據抗真菌蛋白的結構和/或功能，抗真菌蛋白可以分為：包括幾丁質酶和幾丁質酶樣蛋白，幾丁質結合蛋白，親環蛋白樣蛋白，防御素和防御素樣蛋白，脫氧核糖核酸酶，胚胎豐富蛋白，葡聚糖酶，凝集素，脂質轉移蛋白，過氧化物酶，蛋白酶抑制劑，核糖核酸酶，核糖體失活蛋白，儲存2S白蛋白和類似丘腦蛋白等抗真菌蛋白(Ng etc，2013a，b Selitrennikoff2001)。編碼這些抗真菌蛋白的基因許多已經被利用生物技術的方法，獲得轉化植株，這些獲得轉抗真菌蛋白基因的植物獲得更好的抗真菌侵襲性。采用轉基因方法來提高宿主對真菌的抗性，可以減少對有害農藥的使用，并且比傳統的育種方法具有更高的效率(Gust et al。，2010)。這一策略有助于廣泛地發展抗病植物病蟲害(Jha et al。2009；Meiyalaghan etal。2011)。

脫氧核糖核酸酶是近年來從植物中克隆鑒定到的一種新型抗真菌蛋白，這種抗真菌蛋白可能通過水解侵入的外源DNA而發揮作用。比如從蘆筍種子中獲得30kDa脫氧核糖核酸酶具有針對灰霉菌的抗真菌活性(Wang和Ng 2001)。其他研究者已經從西洋參，人參和三喜人參中分離出具有抗真菌活性的核糖核酸酶(Lam和Ng 2001d；Ng et al.2002；Wang andNg2001)。但是，目前還未見報道從細菌中獲得具有脫氧核糖核酸酶活性的抗真菌蛋白及其基因。

發明內容