[發(fā)明專利]PET降解酶的突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810448773.4
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108588052B
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);馬淵;丁明珠;姚明東;何博
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N1/21;A62D3/02;A62D101/28
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉;趙青朵

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了PET降解酶的突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述PET降解酶的突變體是在所述IsPETase的底物結(jié)合位點(diǎn)位置發(fā)生點(diǎn)突變，包括在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼岬腎sPETase突變體M1，在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼崆?17位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岬腎sPETase突變體M2，在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼崆?08位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岬腎sPETase突變體M3。實(shí)驗(yàn)表明相比野生型IsPETase，本發(fā)明所述三種PETase的突變體水解的活性有明顯的提高，能夠在中等溫度(30℃)下高效降解PET。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及PET降解酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，簡稱PET)是由酯鍵連接的對苯二甲酸酯(TPA)和乙二醇(EG)組成的高分子量聚合物。在較寬的溫度范圍內(nèi)具有優(yōu)良的物理機(jī)械性能，長期使用溫度可達(dá)120℃，電絕緣性優(yōu)良，甚至在高溫高頻下，其電性能仍較好，但耐電暈性較差，抗蠕變性，耐疲勞性，耐摩擦性、尺寸穩(wěn)定性都很好。耐用性和其他有利的物理特性使PET成為最廣泛使用的塑料之一。然而，進(jìn)入并積聚在生態(tài)系統(tǒng)中的大量PET對環(huán)境構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)，塑料污染問題極為嚴(yán)重，甚至對海洋生命帶來致命性的影響。

各種細(xì)菌水解酶，如角質(zhì)酶，脂肪酶，羧酸酯酶和酯酶已被證明能夠在不同程度上降解PET。在迄今為止鑒定的PET降解酶中，來自Thermobifida fusca DSM43793的TfH和TfHBTA-2，來自T.fusca KW3的TfCut1和TfCut2，來自植物堆肥中的宏基因組的LC角質(zhì)酶，來自Saccharomonora viridis AHK190的角質(zhì)酶，來自Thermomyces insolens的HiC，以及來自Candida antarctica的脂肪酶B已顯示具有相對較高的降解性。但由于這些酶需要在較高的溫度下才能發(fā)揮最大的生物活性，導(dǎo)致工業(yè)應(yīng)用價(jià)值較低。

2016年，Ideonella sakaiensis一個(gè)新的細(xì)菌物種，它能夠以PET為唯一碳源。I.sakaiensis分泌出來的PETase(IsPETase)可以在中等溫度(30℃)下降解PET，并且具有比其他PET降解酶(如角質(zhì)酶和脂肪酶)相對更高的活性。因而具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。雖然IsPETase能夠在30℃下降解PET，但是降解速率還是較低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的是為了克服原始IsPETase活性較低的問題，提供了新的PETase的突變體。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

本發(fā)明提供的PET降解酶的突變體，是在所述IsPETase的底物結(jié)合位點(diǎn)位置發(fā)生點(diǎn)突變。

在一些實(shí)施方案中，所述PET降解酶的突變體是在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼?R89A)，命名為IsPETase突變體M1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一些實(shí)施方案中，所述PET降解酶的突變體是在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼?R89A)，且IsPETase的117位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?L117F)，命名為IsPETase突變體M2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一些實(shí)施方案中，所述PET降解酶的突變體是在IsPETase的89位精氨酸突變?yōu)楸彼?R89A)，且IsPETase的208位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?I208F)，命名為IsPETase突變體M3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明所述三個(gè)突變體的突變位點(diǎn)都處于IsPETase的底物結(jié)合位點(diǎn)，三個(gè)氨基酸的改變都使得酶底物結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域疏水性提高。