[發明專利]一種三七皂苷糖苷水解酶及其突變體在生產越南人參皂苷R7中的應用

有效

• 申請號: 201810446430.4
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108588054B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 王崢濤;王如鋒;許建和;李娟;楊莉
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N1/20;C12N1/21;C12P33/20;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 李曉峰

本發明公開了一種三七皂苷糖苷水解酶及其突變體在生產越南人參皂苷R7中的應用。本發明提供的蛋白，命名為KfGH01。該酶的原始氨基酸序列如SEQNO：1所示。本發明還涉及表達編碼基因的宿主細胞及其誘導培養條件。本發明的實驗證明，其具有高效轉化三七皂苷Fc并專一生成越南人參皂苷R7的作用，因此具有較好的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種三七皂苷糖苷水解酶及其突變體在生產越南人參皂苷R7中的應用。

背景技術

五加科人參屬植物(如人參Panax ginseng、三七Panax notoginseng、西洋參Panax quinquefolius、越南人參Panax vietnamensis等、竹節參Panax japonicus)具有極高的醫藥價值和悠久的臨床應用歷史。人參屬植物含有多種不同結構類型的化學成分，如皂苷、黃酮、揮發油、氨基酸、多糖等。研究表明，其所含三萜皂苷類化學成分，是預防和治療心腦血管、免疫和神經等系統疾病的主要藥效物質基礎(Chem.Rev.2012，112：3329-3355；J.Pharm.Pharmacol.2006，58：1007-1019)。人參屬植物所含皂苷大部分具有相似的母核結構，主要可分為達瑪烷型和齊墩果烷型；根據母核C-6位是否具有羥基取代，達瑪烷型又可分為原人參二醇(PPD)型和原人參三醇(PPT)型。這些皂苷差別主要存在于其苷元所連糖基的位置、個數或種類不同。最早發現于越南人參根莖當中的越南人參皂苷R7屬于PPD型皂苷，其結構式如附圖1所示。

鑒于該化合物的分離制備較為困難，一定程度上導致了與其相關的藥理活性研究相對空白，目前僅限于本課題組所報道的其具有顯著抑制神經炎癥中下游代謝產物(如LPS及TNF-α聯合誘導因子)的生產和影響多種炎癥基因的表達等作用，在研發與神經炎癥相關的中樞神經系統疾病藥物方面具有一定的潛力(中國中藥雜志，2016，41：1498-1503)。

酶作為一類與化學合成互補的、高效的生物催化劑已被廣泛應用于新藥研發、食品、化工等領域。采用綠色酶制劑等生物催化方法，通過糖苷水解酶從含有多糖基側鏈皂苷的主體結構中選擇性水解掉糖殘基，定向制備專一人參或三七皂苷及其類似物的研究報道逐年增多。此外，隨著基因工程和蛋白質工程技術的飛速發展，越來越多的相關技術不斷應用于生物催化劑-蛋白酶的結構和功能的改造研究當中，其已成為設計和開發新型生物催化劑的重要方法和有效手段。有關糖苷水解酶的定向進化報道較多，主要集中在酶的活力、熱穩定性及性質改變等方面。通過定向進化方法提高具有轉化人參或三七皂苷功能的糖苷水解酶活性，將十分有助于實現特定皂苷化合物的制備。目前，酶法轉化對象大多是集中于連有四個或以下糖基單元的人參皂苷，暫未發現含有四個以上糖單位的人參皂苷或三七皂苷的生物轉化報道，且產物也以單糖或二糖苷為主，如Rg3、Rh2、PPD、PPT、Rh1和C-K等(Process Biochem.2014，49：813-820；Appl.Microbiol.Biotechnol.2012，94：377-84)。五糖基達瑪烷型三七皂苷Fc在三七莖葉中含量相對較高(1.0-1.5％)，其C-20位為-Glc¹-⁶Xyl連接，僅比越南人參皂苷R7多一個外側連接的木糖，因此是酶法制備越南人參皂苷R7理想的候選底物。到目前為止，未見有任何三七皂苷Fc糖苷水解酶及其在制備越南人參皂苷R7的報道。

發明內容

針對現有不足，本發明的目的是公開一種三七皂苷糖苷水解酶及其突變體在生產越南人參皂苷R7中的應用。

本發明的蛋白并名為KfGH01，其為如下的蛋白：

(1)氨基酸序列如SEQ NO：2所示。