[發明專利]一種利用TaqMan探針定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法

在審

• 申請號: 201810437218.1
• 申請日: 2018-05-09
• 公開（公告）號: CN108342512A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 劉紅;李云;于曉丹;戴習林;朱其建;周微微
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 李靜

本發明涉及一種利用TaqMan探針定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法，首先提取待測樣品的基因組DNA；再設計引物和TaqMan探針，最后通過設計的引物和TaqMan探針對待測樣品的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測。發明的檢測方法檢測靈敏度高且特異性好，可以檢測到的最低拷貝數為7.8，用時短且不會產生假陽性的情況，可應用于我國對蝦養殖中的分子疾病檢測和早期預警，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)在1992首次被發現以來已成為對蝦養殖業中最危險的傳染源，其在十足目甲殼動物中宿主范圍廣泛。WSSV基因組是一個均勻分布的圓形的dsDNA 分子，不同毒株基因組大小不同，是迄今為止已測序的最大的病毒基因組之一。三個WSSV 毒株的基因組的全序列已經測定，包括：泰國株293kbp，中國株305kbp和臺灣地區株307kbp，它們之間的相似度為99.3％。WSSV基因組的不同區段具有重要的序列差異，這些差異可用于確定WSSV毒株的起源和傳播，也用于區分野外的毒株，也可能導致PCR檢測出現假陰性。WSSV無包涵體包被，完整的有囊膜的病毒粒子長210nm～380nm，寬70nm～167nm，一個尾狀的附著器結構在病毒粒子的一端。囊膜厚6nm～7nm，核衣殼位于囊膜內，是由球狀蛋白堆積形成的環狀結構，球狀蛋白直徑約為10nm，排列在14個～15個垂直的環紋上，在長軸上每隔22nm有一個球狀蛋白，最終形成一個交叉螺線狀的結構。

在池塘中，感染白斑綜合癥病毒的對蝦聚集在塘邊，癥狀出現1或2天后發生死亡，10 天內累計死亡率可達到100％。在養成池，成年對蝦和幼蝦都對WSSV敏感，大規模的死亡通常發生在放養1或2個月后。許多感染WSSV的對蝦外殼出現明顯的直徑在0.5mm～3.0mm的白點或白斑，同時伴隨其他癥狀，包括身體和附肢變紅、攝食減少、應激反應敏感、表皮易脫落、鰓蓋腫脹，肝腫大顏色偏黃，血淋巴變稀、凝血延遲。

傳統檢測方法以病理學和電子顯微鏡觀察為主，耗時長且不適用。近年來廣泛建立的免疫檢測技術、原位雜交、PCR檢測法、核酸探針雜交法、熒光定量法，不僅迅速、簡便、實用，而且大大提高了檢測靈敏度，可以檢測出潛在感染和早期感染。單種檢測方法通常存在缺陷，而多種方法同時檢測不僅耗時且結果有差異，所以需要建立一種準確的定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術的不足，提供一種利用TaqMan探針定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法。

技術方案

一種利用TaqMan探針定量檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組DNA；

(2)設計引物和TaqMan探針：

上游引物序列：5'-CAAGGGAAC TGT CGC TTC-3'

下游引物序列：5'-CCAAGATCG GCGATAAGT-3'

TaqMan探針的序列為：5'-CAT GCCAGC CGT CTT CCAG-3'；

(3)采用步驟(2)設計的引物和TaqMan探針對待測樣品的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測。

進一步，步驟(3)中，所述熒光定量PCR檢測的反應體系為20μL，包括2×SuperRealcolor PreMix 10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探針0.4μL，ddH₂O 7.4μL，模板DNA 1μL。

進一步，步驟(3)中，所述熒光定量PCR檢測的反應程序為：95℃預變性15min；95℃變性15s，61℃退火60s，采集熒光信號，40個循環。