[發(fā)明專利]一種人HLA-B*5801基因型的試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810431020.2
• 申請日: 2018-05-08
• 公開（公告）號: CN108531599A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 倪曉龍;李亞波;李春鳳;歐陽云
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州泰領(lǐng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發(fā)明提供一種快速檢測人HLA?B*5801基因型的試劑盒及檢測方法，所述試劑盒主要包括：通用引物、通用熒光探針和連接探針，以及連接反應及聚合反應混合液，酶混合液，陰性對照和陽性對照，本發(fā)明特點為通過一種新型的耐熱連接酶反應控制單核苷酸多態(tài)性位點的特異性，只有匹配連接探針的核苷酸才能完成連接反應，并啟動下一步聚合酶鏈式反應，并可通過通用熒光探針檢測到HLA?B*5801基因型，如果不匹配，則無法完成連接，反應終止，所有的檢測過程可在同一個反應體系中完成，相對傳統(tǒng)方法對于HLA?B*5801基因型檢測具有更好的特異性和敏感度。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種快速檢測人HLA-B*5801基因的PCR的試劑盒，以及檢測人HLA-B*5801基因的方法，屬基因診斷領(lǐng)域。

(二)背景技術(shù)

別嘌呤醇是一種次黃嘌呤氧化酶抑制劑，能夠減少尿酸合成并降低血中尿酸濃度，是治療痛風的首選藥物。臨床用于治療：高尿酸血癥；慢性痛風患者；痛風石尿酸性腎結(jié)石或尿酸性腎病。但該藥易引起嚴重的皮膚不良反應，包括較輕微的藥疹，及嚴重的剝落性皮炎、中毒性表皮壞死松解癥等，有較高的致死率。

人類白細胞抗原(HLA)是1組位于第6號染色體上的基因，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復合體，是人類最復雜的遺傳多態(tài)系統(tǒng)，其分布存在明顯的種群特性。1989年，Chan等首次報道了HLA與別嘌呤醇引起不良反應相關(guān)性的研究，結(jié)果顯示中國南方人群中，A*33和B*58為此類不良反應的高風險因素。2005年，Hung等進一步發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇引起嚴重皮膚不良反應的患者中全部攜帶B*5801位點，而在未出現(xiàn)不良反應的患者中其攜帶率僅10％。由于中國漢族人、泰國人、韓國人的HLA-B*5801基因陽性率遠高于白人(高達15％)，因此以上人種使用別嘌呤醇藥物前需檢測HLA-B*5801基因是否攜帶，避免患者誤用別嘌呤醇而誘發(fā)嚴重副反應的風險。

目前用于HLA-B*5801基因檢測的方法主要有以下幾種：

(1)PCR-SBT法:即直接測序法；其可直接獲得DNA序列，鑒定所有存在的多態(tài)性，為最直接、最直觀的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物設(shè)計等多種因素，測序結(jié)果會出現(xiàn)套峰，不利于結(jié)果的判讀，使得PCR-SBT法存在著模棱兩可的結(jié)果，必要時需要人工判讀堿基序列(Adams Et Al.,2004)，且測序技術(shù)需要用到造價昂貴的測序儀，醫(yī)院內(nèi)通常不會配備；

(2)PCR-SSP法:即序列特異性引物法；其根據(jù)各等位基因的核苷酸序列，設(shè)計出一套針對每一等位基因特異性的或組特異性的引物，此即為序列特異性引物；所述SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補性結(jié)合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態(tài)性的目的；所述PCR-SSP法也是臨床上使用最普及的方法。但此種方法操作復雜，耗時較長，且易發(fā)生污染，每批次操作差異較大，無法進行穩(wěn)定快速的批量化操作。

(三)發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測人HLA-B*5801基因型的試劑盒及方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種人HLA-B*5801基因型的試劑盒，所述試劑盒由通用引物、通用熒光探針和連接探針，以及連接反應及聚合反應試劑(酶buffer、dNTP等)，酶混合液，陰性對照和陽性對照組成；

所述通用引物序列如下：

上游引物：5’-GACTCCAATCGAGCATGCAAAC-3’

下游引物：5’-TTCGGAACTATTGTCATGGTCCAA-3’

通用熒光探針序列如下：

5’-FAM-CTGCTGGACCCAGCACCGTACCA-BHQ1-3’；

連接探針1序列如下：