[發明專利]一種核酸擴增反應試劑的凍干微球及其制備方法

有效

• 申請號: 201810429363.5
• 申請日: 2018-05-08
• 公開（公告）號: CN110452972B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 高靜;代有來;蔡亦梅;范東雨;張瑜;李潔昆;任魯風
• 申請（專利權）人: 北京中科生儀科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種核酸擴增反應試劑的凍干微球及其制備方法。凍干微球包括凍干保護劑、緩沖液、酶反應液和特異性核酸擴增反應試劑。凍干微球的制備方法包括以下步驟：核酸擴增反應體系與凍干保護劑混合均勻后，滴入液氮中冷凍成微球，然后將微球在真空冷凍干燥機中冷凍干燥。凍干試劑微球生物活性較好，操作簡單，便于常溫保存和運輸。凍干微球用于實時熒光定量PCR、普通PCR，與全自動核酸檢測儀配套使用，利于現場化快速檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種核酸擴增反應試劑的凍干微球及其制備方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一種體外擴增特定核酸序列的分子生物學技術。核酸擴增技術包括常規PCR、實時熒光定量PCR、等溫核酸擴增技術等。常規PCR是基于DNA或者RNA的PCR技術，被廣泛用于基因克隆和鑒定，疾病診斷和基因突變檢測。實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中，加入熒光染料或者熒光標記的探針，通過熒光信號的累積實時檢測PCR反應進程，利用標準曲線對未知模板進行定量分析。實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、特異性強、反應快速等特點，被用于臨床疾病診斷、動物微生物疾病檢測、食品安全等方面。

PCR反應檢測結果的準確性決定于核酸擴增試劑的活性及正確使用。核酸擴增試劑包括各種酶、緩沖液，鹽離子、鎂離子、寡核苷酸等，進行PCR反應時需要混合所有成分。單個反應體系的多種成分是痕量，操作時會導致一定的實驗誤差，無法保證實驗結果的重復性。在實驗過程中，痕量試劑的使用比較容易出現外源性污染。

核酸擴增試劑尤其是酶制劑受溫度的影響較大，一般需要低溫（-20℃）或者4℃保存，需要干冰運輸，且反復凍融會降低酶的活性。在現場化應急性快速檢測應用時，常規的冷凍保存實驗試劑難以滿足實用需求，必須實現對溫度敏感的酶試劑進行常溫保存。

凍干保護劑具有填充、賦形、穩定的作用，在冷凍和干燥過程中，保護核酸擴增試劑的結構，保持其生物活性。真空冷凍干燥技術可將試劑溶液在較低的溫度下凍結成固態，在真空條件下使其中的固態水升華為氣態，待升華結束后再進行解吸干燥，除去部分結合水。低溫條件下干燥可減少熱敏性酶試劑的降解失活，冷凍干燥試劑微球（Bead）具有較好的形態和最佳的含水量，操作簡便，在常溫長期保存下具有生物活性，適合常溫運輸。核酸擴增試劑凍干微球可應用于臨床床邊體外診斷、突發傳染病的應急處理、檢驗檢疫現場化快速檢測等。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是核酸擴增反應試劑的常溫保存，提供一種核酸擴增反應試劑的凍干微球及其制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種核酸擴增反應試劑的凍干微球，其包括：凍干保護劑、緩沖液、酶反應液和特異性核酸擴增反應試劑。

所述的凍干保護劑包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性劑、消泡劑。海藻糖的濃度為2~30%；甘露醇的濃度為1~20%；右旋糖苷為Dextran 10，Dextran 40或Dextran 70，濃度為0.4~10%； 牛血清白蛋白的濃度為0.1~5mg/ml；表面活性劑為Tween20，Tween80或者Triton X-100，濃度為0.2~5%；消泡劑的濃度為0.03~1.2%。

所述的緩沖液包括以下一種或者幾種成分：Tris-HCl緩沖液、HEPES緩沖液、氯化鉀、氯化鎂、甘氨酸、硫酸銨、氯化銨、硫酸鎂、脫氧核糖核酸三磷酸。

所述的酶反應液包括以下一種或者幾種試劑：DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、RNA逆轉錄酶、RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、ATP硫酸化酶、單鏈結合蛋白、無機焦磷酸酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、拓撲異構酶、解旋酶、RNA酶。

所述的特異性核酸擴增反應試劑包括以下一種或多種試劑：引物、模板、探針、熒光染料。

所述凍干微球的粒徑為0.1~5mm。