[發明專利]基于磁性生物復合材料與鉛離子依賴性DNA酶的電化學生物傳感器檢測凝血酶的方法

有效

• 申請號: 201810424766.0
• 申請日: 2018-05-07
• 公開（公告）號: CN108802142B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 周學敏;朱春紅;朱婉瑩;徐磊
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

本發明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種基于磁性生物復合材料與鉛離子依賴性DNA酶的電化學生物傳感器檢測凝血酶的方法。該方法包括：a)構建磁性生物復合材料Fe3O4@Au?S1/S2；b)鉛離子依賴性DNA酶的酶切輔助；c)電化學生物傳感器的構建：向步驟b)得到的反應物中加入亞甲藍MB，孵育反應得到樣品，將樣品通過磁性誘導吸附到磁性玻碳電極表面，測定MB的DPV信號，建立標準曲線；d)樣品檢測：將凝血酶樣品，按上述方法檢測，測得DPV信號，代入標準曲線得到樣品中的凝血酶濃度。本發明能夠快速、高靈敏高選擇性的檢測凝血酶，克服了現有檢測方法靈敏度低，檢測耗時，成本過高以及步驟繁瑣的缺點。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，更具體地，涉及一種基于磁性生物復合材料與鉛離子依賴性DNA酶的電化學生物傳感器檢測凝血酶的方法。

背景技術

凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，由凝血酶原在Xa因子作用下轉化而來，將纖維蛋白原轉換為纖維蛋白，在凝血級聯機制中有著重要的作用。研究表明，凝血酶與很多疾病如血栓栓塞性疾病、中樞神經性疾病、腎病等有著密切的關系，其濃度的改變會導致功能的轉變。例如，在腎組織中，低濃度的凝血酶有細胞保護作用，而高濃度的凝血酶會引起腎臟損傷。因此，定量檢測復雜生物樣品中的凝血酶含量對臨床研究和早期診斷有重要的意義。

目前已經建立了基于適配體的比色法、熒光法、電化學發光法、電化學方法，極大地提高其選擇性，其中電化學方法由于具有檢測迅速、設備簡單便攜的優點引起關注。但是這些電化學方法大多需要進行復雜的電極修飾，對實驗條件、環境要求嚴格，技術上限制了廣泛應用。因此，需要設計一個簡單、準確、靈敏的電化學方法用于凝血酶的檢測。

磁性Fe₃O₄@Au納米材料的磁性特征滿足在實驗過程簡單快速的磁性分離，避免耗時較長的超濾離心操作，而且在測定時通過磁控誘導在電極表面成膜，利用磁性納米材料吸附固定在磁性玻碳電極表面，而且去除磁芯后可使磁性材料自行脫落，省去了漫長的拋光打磨電極的過程，具有自清潔的特點。另外，它具有較大的比表面積，可以通過表面修飾與DNA材料結合得到生物納米材料。

DNA分子除了具有基因的遺傳特性外，同時也是一個結構精巧的一維納米線，包括適配體、DNA酶、適配體和DNA酶復合物Aptazyme。由于DNA序列設計靈活、合成方法成熟、價格適宜的優勢，成為目前研究的熱門材料。其中，適配體特異性識別目標物，提高選擇性，擁有與抗原-抗體反應相匹敵的靈敏度，穩定性好，可以作為抗體的替代物。金屬離子依賴性DNA酶是一段特定的單鏈DNA序列，在二價金屬離子輔助下具有切割底物酶活性，和底鏈互補后在特定的位點將底鏈分解成兩部分。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于磁性生物復合材料與鉛離子依賴性DNA酶的電化學生物傳感器檢測凝血酶的方法，能夠快速、高靈敏高選擇性的檢測凝血酶，克服了現有檢測方法靈敏度低，檢測耗時，成本過高以及步驟繁瑣的缺點。

為了實現上述目的，本發明提供一種基于磁性生物復合材料與鉛離子依賴性DNA酶的電化學生物傳感器檢測凝血酶的方法，包括如下步驟：

a)構建磁性生物復合材料Fe₃O₄@Au-S1/S2：將修飾有引物鏈S1的磁性Fe₃O₄@Au納米粒與凝血酶適配體S2共孵育；

b)鉛離子依賴性DNA酶的酶切輔助：向步驟a)構建的復合材料中加入不同濃度的凝血酶，在鉛離子依賴性DNA酶S3和鉛離子的輔助下共孵育；

c)電化學生物傳感器的構建：向步驟b)得到的反應物中加入亞甲藍MB，孵育反應得到樣品，將樣品通過磁性誘導吸附到磁性玻碳電極表面，測定MB的DPV信號，建立標準曲線；

d)樣品檢測：將未知濃度的凝血酶樣品，按上述方法檢測，測得DPV信號，代入標準曲線得到樣品中的凝血酶濃度；