[發明專利]GmMDH12基因在促進大豆結瘤固氮能力方面的應用

有效

• 申請號: 201810421922.8
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN108795956B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 田江;陳志堅;廖紅;梁翠月;白振龍
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H5/06;A01H6/54
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

本發明公開了GmMDH12基因在促進大豆結瘤固氮能力方面的應用。具體是蘋果酸脫氫酶基因GmMDH12控制根瘤蘋果酸合成及其在促進豆科作物根系結瘤方面的應用。本發明研究發現，GmMDH12具有調控大豆根瘤蘋果酸合成的功能，超量表達GmMDH12顯著增加了大豆轉基因復合植株根瘤內源蘋果酸濃度，增加了根瘤數和根瘤生物量，從而提高了植株氮含量和生物量。依據本發明，GmMDH12基因具有通過轉基因技術提高豆科作物生物固氮功能的潛力，對提高作物養分高效利用以及環境友好型可持續農業的發展具有重要的理論和實踐意義。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域。更具體地，涉及GmMDH12基因在促進大豆結瘤固氮能力方面的應用。

背景技術

豆科植物根系能夠和根瘤菌形成互利互補的共生系統--根瘤。宿主植物能夠為根瘤菌的生長提供碳源和合適的生長環境，而根瘤菌則通過固氮酶的作用進行生物固氮，為宿主生長提供氮源。將根瘤菌接種技術應用于農業生產，改善作物氮營養，是豆科作物節肥增產的有效措施，在農業生產中發揮著重要的作用 (Qin et al., 2012)。豆科植物根瘤菌的生長、根瘤的形成以及生物固氮是一個復雜的生理生化過程，由許多代謝途徑共同參與完成，其中包括碳代謝途徑 (Hernández et al., 2009)。大豆 [Glycine max (L.) Merr]是全世界范圍內一種重要的油料和蛋白質作物，是食用油和食用蛋白的重要原料，也是我國最重要的豆科作物。大豆能夠和根瘤菌互利共生形成根瘤，可以改善大豆的氮營養，降低氮肥投入。

在根瘤碳代謝過程中，磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate, PEP) 是一個重要的中間代謝產物。在根瘤中，PEP主要通過兩個途徑被同化，一個是合成有機酸進入根瘤的三羧酸循環途徑，另一個則是進入氮同化的氨基酸代謝途徑 (White et al., 2007)。研究認為，在根瘤菌中，碳代謝的主要方向是經PEP生成草酰乙酸 (Oxaloacetate, OAA)，最后合成蘋果酸的途徑 (Le Roux et al., 2008)。通過¹⁴C標記試驗，發現在根瘤中的蘋果酸具有標記信號，暗示蘋果酸可能作為碳代謝的產物在根瘤中積累，蘋果酸被認為是根瘤菌呼吸代謝過程中的重要碳源，進一步被用于根瘤菌的代謝消耗 (Rosendahl et al.,1990; Le Roux et al., 2006)。

蘋果酸脫氫酶基因MDH (EC.1.1.1.37) 能催化蘋果酸與OAA的可逆轉化，是三羧酸循環途徑中的關鍵酶。在苜蓿、豌豆和菜豆等豆科作物中，發現接種根瘤菌可以顯著提高MDH酶活性，而根瘤中MDH酶活性的增加被認為主要作用于調控根瘤碳代謝途徑中蘋果酸的合成 (Miller et al., 1998; Colebatch et al., 2002; Le Roux et al., 2008; Hernández et al., 2009)。并且，大量研究也表明，超量表達MDH基因，能夠增加苜蓿，大豆和煙草等植株內源蘋果酸的含量 (Tesfaye et al., 2001; Lü et al., 2012)。但是，調控根瘤蘋果酸合成的重要基因，以及增加蘋果酸的合成是否能夠促進根系結瘤、提高豆科作物的氮營養仍不清楚。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，通過蛋白質組學和定量PCR等分析方法，在大豆根瘤中同源克隆了一個GmMDH12基因（序列如SEQ ID NO.3所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示），發現其在蛋白及轉錄水平上同時受到低磷增強表達，證明了GmMDH12基因編碼的蛋白具有促進根瘤蘋果酸合成的生物學功能，進而促進了根系結瘤，并最終提高了轉基因材料根瘤固氮能力及生物量。