[發明專利]豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201810420766.3
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN108611359B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 陳博;金梅林;豆青;徐高原
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/01;C07K1/34;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于基因工程疫苗領域，公開了豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法及其應用，本發明首次建立了PCV3病毒樣顆粒的制備方法，本發明以優化后的豬圓環病毒3型CAP蛋白為目的蛋白，使用的原核表達系統和自建的蛋白自組裝緩沖液體系，成功構建了豬圓環病毒3型病毒樣顆粒，使抗原的生產變得容易，成本低廉而且產量高。構建出的病毒樣顆粒免疫仔豬后，能快速產生針對3型豬圓環病毒的抗體，具有廣泛的應用價值。

技術領域

本發明涉及基因工程疫苗領域。具體地說，涉及豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法及其應用。

背景技術

豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒，20面體對稱，直徑17-20nm。豬圓環病毒相關疾病是目前危害養豬業的一個主要疾病，臨床表現為斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)，呼吸道和腸道疾病，繁殖障礙和豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)。PCV目前主要有3個血清型，即豬圓環病毒1型(PCV1)、豬圓環病毒2型(PCV2)和豬圓環病毒3型(PCV3)。其中，PCV1對豬沒有致病性。PCV2和PCV3與豬的圓環病毒相關疾病密切相關。2015年，PCV3首次在美國被鑒定到。最近，華中農業大學的何啟蓋教授也在國內首次檢測出致病性的PCV3。PCV3基因組含有3個主要的開放閱讀框，即ORF1，ORF2和ORF3。其中PCV3ORF2由645個堿基組成，編碼214個氨基酸，構成病毒的衣殼蛋白(CAP)，是主要的免疫原性蛋白。PCV3與PCV2的同源性較低，目前防治PCV2的方法并不能很好的用于PCV3。因此，急需一種能夠用于預防PCV3感染的有效疫苗。

病毒樣顆粒(Virus Like Particles，VLP)是利用重組表達的方法，在體外將重組病毒衣殼蛋白組裝成與天然病毒有相似結構的空心顆粒。該顆粒的特點是不含有病毒的遺傳物質，其形態、大小、組成和抗原表位都與天然病毒相同或極為相似。具有良好的免疫原性，且安全性遠好過傳統疫苗。目前，VLP疫苗已成為新型疫苗研發的重要方向。然而VLP疫苗的研發難度較大。重組病毒衣殼蛋白只有在滿足特定的條件下，才能自我組裝成與天然病毒有相似結構的空心顆粒。因此，目前商品化的VLP疫苗較少。

表達與組裝VLP疫苗的系統有很多。常用的有大腸桿菌表達系統、桿狀病毒表達系統和酵母表達系統等。其中，相較其它的表達系統，大腸桿菌表達系統有著成本低，表達量大的優勢。因此，大腸桿菌表達系統成為大批量生產的首選。但同時，大腸桿菌表達系統用于VLP制備也存在著許多技術難點。首先，因為密碼子使用頻率的不同，動物病毒的基因常常難于在大腸桿菌表達系統中表達。其次，大腸桿菌分子伴侶較少，常常造成重組蛋白無法正確的折疊，從而影響重組衣殼蛋白組裝成VLP。另外，相對于真核表達系統，大腸桿菌缺乏很多關鍵的蛋白酶，無法去除阻礙衣殼蛋白組裝的多余氨基酸序列。針對不同的動物病毒都需要摸索出特定的表達與包裝條件，才能使用大腸桿菌表達系統制備出相應的VLP。

PCV3作為豬源病毒，其CAP蛋白在大腸桿菌中的表達量受著密碼子使用頻率偏好性的影響，CAP蛋白本身含有大量的疏水氨基酸，其在大量表達時容易形成不可溶的包涵體，從而無法形成VLP結構，另外，CAP蛋白自組裝成VLP需要在特定的條件下進行，因此，本研究存在一定的難度。

發明內容

針對目前存在的各種問題，本發明提供了一種豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法，利用本發明的方法，可成功的大量制備豬圓環病毒3型病毒樣顆粒，適合工業化生產。

本發明的另一個目的在于提供了一種豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法的應用。為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

豬圓環病毒3型病毒樣顆粒的制備方法，包括下述步驟：