[發(fā)明專利]用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡與制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810417752.6
• 申請(qǐng)日: 2018-05-04
• 公開（公告）號(hào): CN108398565A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯永平;梁展鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州敏捷生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533;G01N33/558
• 代理公司: 廣州市科豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

1.一種用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡，包括底板(1)，在底板(1)上依次銜接有樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維膜(4)和吸水墊(5),其特征在于，所述結(jié)合墊(3)上設(shè)有熒光微球標(biāo)記的CRP單克隆抗體(31)和熒光微球標(biāo)記的羊抗雞IgY(32)，所述的硝酸纖維膜(4)設(shè)有一條包被雞IgY的質(zhì)控C線，以及一條包被CRP單克隆抗體的檢測(cè)T線。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡，其特征在于，還包括樣品稀釋液瓶(6)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡，其特征在于，所述的樣品稀釋液瓶(6)中含的樣品稀釋液含1％S9和0.1％ Triton X-100的的0.1M的pH7.8 Tris-鹽酸緩沖液。

4.制備權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡的方法，在底板(1)上依次銜接有樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維膜(4)和吸水墊(5)，其特征在于，

A)所述的樣品墊的制備方法為：

1)配制樣品墊處理液：含1％牛血清白蛋白、2％聚乙二醇4000和0.5％Triton X-100的pH9.00.1M的甘氨酸緩沖液；

2)將步驟1)中制備的緩沖液5.0μl/cm的濃度噴涂于玻璃纖維上；

B)所述的結(jié)合墊(3)的制備方法為：

1)將用熒光微球標(biāo)記CRP單克隆抗體和用熒光微球標(biāo)記的羊抗雞IgY按照體積比20:1混合均勻，超聲2s，間歇5s，重復(fù)3次；

2)按3.5μl/cm、0.02MPa噴至剪裁后的結(jié)合墊上；

C)所述的反應(yīng)膜的制備方法為：

1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液將雞IgY稀釋到1mg/mL，即為C質(zhì)控線工作液；

2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液將CRP單克隆抗體稀釋到1mg/mL，即為T檢測(cè)線工作液；

3)取底板(1)粘貼硝酸纖維膜；

4)在硝酸纖維膜上劃T線和C線，劃線濃度均為1μL/cm；

5)完成后將片材放置在37℃干燥箱中干燥過夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于檢測(cè)犬C-反應(yīng)蛋白的免疫熒光層析檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于，熒光微球標(biāo)記CRP單克隆抗體的制備方法為：

1)稀釋熒光微球：取一離心管，加入1mL標(biāo)記緩沖液0.1M MES緩沖液，加入熒光微球1mg，渦旋混勻；

2)微球的活化：在上述離心管中加入20μl-50μl標(biāo)記活化劑A和20μl-50μl標(biāo)記活化劑B，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上反應(yīng)30min；

3)活化淬滅：將活化后的熒光微球20000g離心30min，棄上清，留取沉淀，加入500μl淬滅劑，超聲2s；

4)抗體的標(biāo)記：在超聲重懸后的熒光微球中加入20-200μg CRP單克隆抗體，渦旋混勻，置于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上反應(yīng)30min；

5)封閉：加入2mL標(biāo)記封閉液，超聲2s，間歇5s，重復(fù)3次，超聲完成后置于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上反應(yīng)30min；

6)純化：完成上述反應(yīng)后，19000g離心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2mL標(biāo)記熒光微球稀釋液，超聲，工作2S，間歇5S，重復(fù)3次。