[發(fā)明專利]鑒別A型和B型牛多殺性巴氏桿菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針以及檢測方法

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• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108411014A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳君彥;張宸;王艷杰;王秀明;王云凌;劉建奇;武槿賢;劉國英;魏學(xué)峰;韓四娥;黃海碧;史文瑞;徐麗媛;范秀麗
• 申請（專利權(quán)）人: 金宇保靈生物藥品有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 鄒亮;魯兵

本發(fā)明涉及鑒別A型和B型牛多殺性巴氏桿菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針以及檢測方法。屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，該引物和探針是依據(jù)A型牛多殺性巴氏桿菌的hyaD?hyaC區(qū)域基因和B型牛多殺性巴氏桿菌的bcbD區(qū)域基因的序列作為檢測序列設(shè)計(jì)得到。利用本發(fā)明檢測操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，能夠在A型和B型牛多殺性巴氏桿菌疫苗菌種的鑒定、篩選及生產(chǎn)質(zhì)控中發(fā)揮作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種鑒別A型和B型牛多殺性巴氏桿菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針、包含該引物和探針的檢測試劑盒、以及使用該引物和探針或檢測試劑盒對A型和B型牛多殺性巴氏桿菌進(jìn)行非疾病診斷目的檢測的方法。

背景技術(shù)

巴氏桿菌病

巴氏桿菌病(Pasteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,PM) 引起的一類傳染病，可見于各種畜禽和人類。主要引起動物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎。動物之間互相傳染，人被動物咬傷可感染。牛巴氏桿菌病潛伏期短，傳播速度快，死亡率高，常對畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

多殺性巴氏桿菌最早發(fā)現(xiàn)于1881年，多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜型分為A、B、 D、E和F型。近年來，綜合國內(nèi)外報(bào)道發(fā)現(xiàn)引起牛多殺性巴氏桿菌病的主要血清型是A型和B型。

牛多殺性巴氏桿菌的診斷

多殺性巴氏桿菌的常規(guī)檢測方法包括細(xì)菌分離培養(yǎng)以及分子生物學(xué)檢測。細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法不僅耗時(shí)，而且僅憑鏡檢存在較大的誤差。目前廣泛使用的普通PCR莢膜分型檢測法可作為實(shí)驗(yàn)室診斷的常規(guī)方法，準(zhǔn)確且耗時(shí)少。但普通PCR檢測方法的敏感度有限，細(xì)菌數(shù)較少的情況下很難檢出。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一種對基因組進(jìn)行檢測的相對定量技術(shù)，與普通PCR技術(shù)相比，增加了一個(gè)兩端帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知的模板進(jìn)行定量分析(Heid CA,Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.GenomeRes.1996Oct；6(10):986-94.)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以利用多種熒光基團(tuán)實(shí)現(xiàn)多種基因的檢測，并可利用寡核苷酸探針實(shí)現(xiàn)相似性較高基因的鑒別。目前，該方法已廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量、以及動物病原體的檢測、畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定等領(lǐng)域。中國專利公開第CN107164557A號公開了一種同時(shí)檢測多殺性巴氏桿菌及其莢膜A型雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的引物及應(yīng)用，但其并沒有進(jìn)行A型和B型多殺性巴氏桿菌的鑒別。

牛多殺性巴氏桿菌的預(yù)防

畜禽多殺性巴氏桿菌病的防治主要使用多殺性巴氏桿菌疫苗。目前，臨床上使用的牛多殺性巴氏桿菌疫苗，多用于預(yù)防牛出血性敗血癥，疫苗株多為B 型多殺性巴氏桿菌。雖然該類疫苗在控制牛源巴氏桿菌病中起到了重要的作用，但是對不同血清型的交叉保護(hù)性弱。因此，越來越多的研究人員將目光投向了A 型、B型牛多殺性巴氏桿菌二聯(lián)苗的開發(fā)。因此，準(zhǔn)確、特異、快速地檢測A型和B型牛多殺性巴氏桿菌抗原的水平在疫苗生產(chǎn)監(jiān)控等方面具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒別A型和B型牛多殺性巴氏桿菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和TaqMan探針。

該引物和TaqMan探針依據(jù)A型牛多殺性巴氏桿菌的hyaD-hyaC區(qū)域基因和B型牛多殺性巴氏桿菌的bcbD區(qū)域基因的序列作為檢測序列設(shè)計(jì)得到。