[發明專利]一種利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法

在審

• 申請號: 201810387827.0
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN110408585A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 小威廉·K·博斯;孫中鋒;王新榮
• 申請（專利權）人: 西安新長安再生醫學科技研發有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京中原華和知識產權代理有限責任公司 11019
• 代理人: 壽寧;張華輝

本發明提供一種耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，其特征在于包括以下步驟:皮膚組織采集；組織復蘇及酶解；細胞原代培養，細胞純化；成纖維細胞擴增培養；成纖維細胞檢測；成纖維細胞凍存；通過本發明所制備的成纖維細胞其活性更高、純度更高，可用于制備高療效的組織工程產品及美容產品。

技術領域

本發明涉及一種成纖維細胞分離培養方法，尤其涉及一種利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法。

技術背景

成纖維細胞是疏松結締組織中最主要的細胞，常附著在膠原纖維上，能合成和分泌大量的膠原蛋白。正常情況下，其處于相對靜止狀態，當皮膚受損時可進入增殖狀態，參與組織修復，是皮膚組織受損后的主要修復細胞。以傷口愈合過程為例，成纖維細胞通過有絲分裂大量增殖，并從4～5天或6天開始合成和分泌大量的膠原纖維和基質成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，為表皮細胞的覆蓋創造條件。

皮膚皺紋是由內源性自然生理衰老和外源性面部肌肉運動頻發、表皮組織水分流失、不良環境因素等因素共同作用的結果。目前應用的多種除皺方法如面部提緊術、化學去皮、激光除皺和生物制劑注射法等都存在著不等的副作用且治療效果不明顯，所以尋找一種能有效除皺的方法已成為國內外相關整形美容學者們最關注的問題。近些年來隨著皺紋產生機理研究的深入發現，在皮膚中成纖維細胞主要存在于真皮網織層中，是真皮層中的重要細胞，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用。而成纖維細胞的減少亦是引起皺紋產生的重要因素,因此推測在皺紋區域補充成纖維細胞可能對改善皺紋有明顯的作用。

基于此，整形美容研究者們開始根據此機理開發美容產品，而在這些美容產品中最受人關注的為自體成纖維細胞除皺美容產品，但因現有除皺產品中成纖維細胞活性低，導致除皺美容效果并不十分理想。

基于成纖維細胞在組織修復及除皺美容中的作用及現有產品中成纖維細胞活性不足的特點，開發出高活性的成纖維細胞培養方法對于后期組織修復及除皺美容產品的開發至關重要。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種從耳后皮膚組織培養成纖維細胞的方法，該制備方法克服了現有培養技術的缺點，縮短了培養周期，增加了細胞數量，提高了培養的成纖維細胞的純度及活性。

為解決上述問題，本發明提供了一種利用耳后皮膚培養成纖維細胞的方法，包括以下步驟

(1)組織采集：無菌條件下取耳后皮膚組織，置入含DMEM(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基)培養液的培養皿中,組織樣本經兩次DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffer saline，磷酸鹽緩沖液)離心清洗后，加入凍存液，冷凍保存；

(2)組織復蘇及酶解：取出凍存組織，經水浴鍋中快速解凍后用75％乙醇消毒1-3min；隨后用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和PBS(Phosphate buffersaline，磷酸鹽緩沖液)清洗1-3次；清洗后的皮膚組織加入中性裂解酶過夜消化后，去除表皮，用無菌剪刀將真皮組織剪碎成小塊；

(3)原代培養(P0)：將步驟⑵中剪碎后的皮膚組織加入到成纖維細胞專用培養液，混勻后移至培養瓶內，在含有5％CO₂，37℃的培養箱中培養10-15天；

(4)細胞純化：當步驟⑶中細胞融合度達到50％-90％時，用含0.25％胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)消化后移至培養瓶中培養3-5天，當細胞融合度達到90％以上時，消化收獲細胞，此時為第一代細胞(P1)；將第一代細胞移至培養瓶中培養2-3天后，消化收獲細胞，此時為純的成纖維第二代細胞(P2)；