[發明專利]一種利用纖維素固定化CBD-EndoS融合酶的方法

有效

• 申請號: 201810358946.3
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108623696B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 吳志猛;周志昉;趙愷
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N11/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種利用纖維素固定化CBD?EndoS融合酶的方法，屬于固定化酶技術領域。本發明利用CBD?EndoS的CBD標簽將融合蛋白特異性固定于纖維素微球上，不同于傳統固定化酶“先純化后固定”，實現了一步固定純化，將粗酶中的CBD?EndoS蛋白固定在纖維素載體上，操作簡單，方便快速，大大簡化了固定化步驟。應用本發明的方法制備的固定化酶反復使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃條件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。本發明有望實現工業化，有助于EndoS酶在抗體修飾研究領域的廣泛應用。

技術領域

本發明涉及一種利用纖維素固定化CBD-EndoS融合酶的方法，屬于固定化酶技術領域。

背景技術

EndoS是一種來源于化膿鏈球菌的糖苷內切酶，可以高度特異性地水解抗體Fc結構域上的N糖鏈。因為抗體連接了先天免疫和適應性免疫，是許多人類免疫反應的中心因素，所以分析和調控EndoS的酶活性會對生物醫學的眾多領域產生影響。臨床上，EndoS增強了化膿性鏈球菌逃避人類免疫反應的能力，因此Endo-S抑制劑能夠用于改善炎癥患者的癥狀。在治療上，EndoS已經在動物模型中顯示出巨大的治療潛力，可以用于依賴自身抗體的多種自身免疫疾病的治療；微調EndoS的特異性和活性是將其作為人類蛋白質治療劑進一步發展的重要研究方向。在生物技術上，EndoS是一種獨特的糖蛋白修飾酶，具有除去抗體上糖鏈的功能，而其突變體具有將糖鏈連接到抗體上的功能；利用EndoS及其突變體將均一的糖鏈連接到抗體上，產生均一糖基化抗體庫，其對于發揮工程化抗體的全部潛力是至關重要的。

目前EndoS的菌體表達量較低，無法滿足未來大規模的抗體修飾研究的需要。酶的固定化是一種將酶限制在一定的載體上，可以連續催化合成產物，并且在反應結束后可以回收和再利用的技術。因此發展EndoS酶的固定化技術及其應用，有助于實現EndoS酶在抗體研究領域的廣泛應用。

纖維素是蛋白質固定化的理想載體，因為其具有低成本，惰性，穩定的優點，并且容易以不同形式獲得。有研究表明，異源蛋白質融合纖維素結合域(CBD)后形成雜交蛋白質，其具有活性且能夠和纖維素結合。因此，通過纖維素結合域將融合蛋白吸附到纖維素上可以作為一種簡便的酶固定化技術。另一方面，纖維素載體及其標簽還具有一步實現蛋白純化和固定化的潛力。(參考文獻Barbosa O,Ortiz C,Berenguer-Murciaetal.Strategies for the one-step immobilization–purification of enzymes asindustrial biocatalysts[J].Biotechnology advances,2015,33(5):435-456.)

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種具有纖維素結合活性和糖苷內切活性的雙功能融合蛋白CBD-EndoS，含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本發明的第二個目的是提供含有SEQ ID NO.2所示CBD序列的表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述載體包括pET系列載體，如pET34b(+)、pET35b(+)等。

在本發明的一種實施方式中，所述載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明的第三個目的是提供表達所述雙功能融合蛋白CBD-EndoS的細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述細胞包括真菌細胞或細菌細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述細胞為重組大腸桿菌細胞，所述重組大腸桿菌是用所述的表達載體構建的重組質粒pCBD-EndoS轉化至E.Coli BL21的重組細胞。