[發(fā)明專利]通過內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜檢測微生物的內(nèi)標(biāo)校正方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810346086.1
• 申請日: 2016-11-25
• 公開（公告）號: CN108593753B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戰(zhàn)曉微;馬慶偉;宋召;譚甜霞
• 申請（專利權(quán)）人: 北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種通過內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物來質(zhì)譜檢測微生物的方法，該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物具有已知的分子量和質(zhì)荷比，其在微生物檢測過程中并不干擾微生物特征蛋白的峰值譜圖。本發(fā)明還提供了所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物組合、試劑組合物及其相關(guān)檢測產(chǎn)品。本發(fā)明中利用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正單個微生物樣品檢測的方法，可適用于包括真菌，細(xì)菌等各類用于MALDI?TOF MS檢測的微生物樣品中，提高微生物鑒定的準(zhǔn)確率，同時彌補(bǔ)了目前市場上只有外部標(biāo)準(zhǔn)物做校正的不足。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)檢測微生物樣品檢測的內(nèi)標(biāo)校正。

背景技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorptionlionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技術(shù)，是近年來飛速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)之一，具 有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點，為生命科學(xué)研究與臨床重大疾病預(yù)警和輔助診斷等提供快 速、高通量的分析測試手段，同時也是一種很好的鑒定病原微生物的方法。

MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳 遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過 程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即 測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。盡管MALDI-TOF-MS的準(zhǔn)確度高 達(dá)0.1％～0.01％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)。MALDI-TOF MS技術(shù)具有 快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高通量、低成本等特點；MALDI-TOF MS技術(shù)是臨床微生物的常規(guī)快速分析技 術(shù)，也是耐藥微生物的分析技術(shù)之一；MALDI-TOF MS技術(shù)為有病原菌資源庫的構(gòu)建提供了有效的 鑒定技術(shù)支持。但由于系統(tǒng)誤差等因素影響實驗結(jié)果的精確定量，因此在質(zhì)譜檢測樣品時，引入已知 濃度和比例的內(nèi)標(biāo)，從而提高單個微生物樣品鑒定的準(zhǔn)確度和精密度。

目前曲線擬合的方法在國內(nèi)外均有較為普遍的應(yīng)用，Jiangyue Wu等(Anal.Chem.1997,69, 3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的擬合曲線法對環(huán)孢菌素進(jìn)行了定量測試；Mazarin等(Anal.Chem. 2006,78,2758-2764)結(jié)合脈沖梯度旋轉(zhuǎn)核磁共振和MALDI-TOF-MS定量測定多聚物時，同樣采用了 擬合曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)校正；2009年，呂爽等人利用擬合曲線，成功開發(fā)了一種磷酸化肽的 MALDI-TOF-MS定量方法。

該技術(shù)是在完整的微生物中添加酸性基質(zhì)輔助細(xì)胞裂解，激光激發(fā)細(xì)胞裂解物(小蛋白或多肽)形 成肽質(zhì)量指紋譜，與已構(gòu)建的屬、種水平的共性參考譜庫進(jìn)行比對分析，從而實現(xiàn)微生物的鑒定。而 各種特征肽或肽指紋的檢測結(jié)果通過一系列具有特定質(zhì)荷比(M/Z)的峰值曲線進(jìn)行標(biāo)識。在利用 MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀采集樣本的準(zhǔn)確性是蛋白指紋譜微生物識別體系的關(guān)鍵因素，如果在檢測過 程中由于細(xì)胞裂解物的雜質(zhì)或系統(tǒng)誤差(繼續(xù)補(bǔ)充)的影響，會導(dǎo)致檢測結(jié)果的峰值曲線出現(xiàn)一定程 度的誤差(例如1-10個Da分子量的峰值偏移)，因此一般需要通過標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行校正，以使得測定峰 值曲線與實際峰值曲線吻合。

袁湘林等(《分析化學(xué)研究報告》，2001年第29卷第1期)報道了在基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜用于人參皂甙Rg3的定量分析中，選擇蘆丁作為內(nèi)標(biāo)物,在重現(xiàn)性和線性方面都優(yōu)于棉子糖。分辨率的提高以及以相對峰面積代表待測物濃度，可使平均相對誤差明顯降低,改善定量結(jié)果。然而，該方法并非用于質(zhì)譜檢測微生物中，與MALDI-TOF MS檢測微生物采用的線性模式不同的是，人參皂甙Rg3的定量分析所采用的是反射模式，且待測樣品的檢測范圍小于1000Da，同時其檢測區(qū)間僅限于400-900(M/Z)，無法滿足微生物的檢測區(qū)間，因此受到了限制。