[發明專利]一種甲殼素酶及其應用

有效

• 申請號: 201810345527.6
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108342374B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 毛相朝;高麗;孫建安;薛長湖
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12P19/26;C12P19/14;C12P19/12
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明的目的在于提供一種具有高效降解率的甲殼素酶，通過克隆白長鏈霉菌Streptomyces albolongus ATCC 27414基因組中編碼甲殼素酶的基因，并構建重組載體，將其轉入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中誘導表達，得到高活性的可溶性甲殼素酶。通過Ni柱親和層析，純化得到甲殼素純酶，并對其酶學性質和水解機制進行研究，該酶的最適溫度和最適pH分別為55℃和5.0，比酶活為66.2U/mg,降解甲殼素的主要產物為甲殼二糖。有望將本發明應用于甲殼寡糖的制備，具有潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于功能基因篩選技術領域，具體涉及一種甲殼素酶及其應用。

背景技術

甲殼素又稱甲殼質、幾丁質等，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)，通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的線性高分子多糖聚合物，甲殼素廣泛存在于甲殼類動物外殼、真菌細胞壁、昆蟲、藻類細胞以及軟體動物的軟骨或內殼，是自然界中僅次于纖維素的第二大多糖聚合物。但是甲殼素的不溶性是甲殼素應用的最大限制性因素，而甲殼素的降解產物甲殼寡糖(聚合度為2～10)，具有更廣泛的生物活性，如；抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、治療關節炎、腸道炎等藥理功能活性，此外，甲殼寡糖也是腸道有益菌群的促生長因子，可作為功能性食品或飲料的補充劑。因此，制備甲殼寡糖是近年來國內外研究的熱點，而且也是甲殼素高值化利用的有效途徑。

目前，甲殼寡糖的制備方法主要分為：化學法、物理法和酶法。化學法主要利用鹽酸、過氧化氫等化學試劑降解甲殼素，得到分子量3000的低聚糖，但是由于反應條件比較劇烈，反應過程無法控制，反應產物純度較低，而且需要消耗大量化學試劑，不僅造成資源的大量浪費，而且容易給環境帶來負擔。物理法是利用超聲波、微波、γ射線和光等能量使甲殼素降解，但是物理法制備的產物產量低，產物分布不均一，在工業化生產中沒有得到廣泛的應用。酶法制備甲殼寡糖，反應條件較溫和，反應過程容易控制，且產物較純易分離，對大規模生產甲殼寡糖具有重要意義；但目前缺少特異性降解甲殼素來制備特定甲殼寡糖的甲殼素酶。

發明內容

本發明的目的在于提供一種甲殼素酶及其應用，克服目前現有技術的不足；

本發明的提供的甲殼素酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

用于編碼上述甲殼素酶基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2；

本發明提供一種表達載體，用于表達上述的甲殼素酶；

本發明還提供一種轉化體，攜帶有上述的重組表達載體；

本發明再一個方面提供一種制備甲殼二糖的方法，是使用上述的甲殼素酶降解甲殼素來制備甲殼二糖。

本發明的甲殼素酶用于降解膠質甲殼素，主要產物為甲殼二糖，產量達72％，次要產物為N-乙酰-D-葡萄糖胺，產量達38％。

附圖說明：

圖1：本發明的甲殼素酶親和層析后的SDS-PAGE電泳圖，1：Marker；2：粗酶；3：純酶

圖2：本發明的甲殼素酶，pH變化對相對酶活的影響。

圖3：本發明的甲殼素酶，溫度變化對相對酶活的影響。

圖4：本發明的甲殼素酶作用于甲殼六糖，產物的變化趨勢。

圖5：本發明的甲殼素酶，酶解產物的高效液相色譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實例對本發明的的方法作進一步說明，實施例中所用到的實驗條件可以根據已有技術進行選擇。對于實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。

對于本發明所涉及的術語如下：