[發明專利]一種細胞色素c檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201810336002.6
• 申請日: 2018-04-16
• 公開（公告）號: CN108956726B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 溫俊林;周順桂;余震;楊貴芹;湯佳
• 申請（專利權）人: 廣東省生態環境技術研究所
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種細胞色素c檢測方法及試劑盒，將細胞色素c固有的過氧化物酶活性與絲網印刷碳電極檢測技術相結合，構建一種原位的細胞色素c的檢測方法，而且無需破壞性樣品，具有原位檢測的優點；并且具有更好的檢測性能、較高的靈敏度，檢測限為0.816nM，過程簡單、快速，可進行實地檢測。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，涉及一種細胞色素c檢測方法及試劑盒。

背景技術

細胞色素c由鐵、蛋白質和卟啉構成，是線粒體呼吸鏈的重要組成和指示細胞凋亡的標志物。此外，細胞色素c還有許多其他重要的作用，例如協助微生物將胞內氧化有機物產生的電子轉移至難溶性金屬(氫)氧化物和固體電極。

傳統細胞色素c檢測方法，如血紅素染色和蛋白質印跡，具有可視化和定量的優勢，但是它們的靈敏度低和檢測過程復雜。光譜法雖然簡單易用，但僅限于定性監測細胞色素c的氧化還原狀態。電化學技術由于其簡單的操作、高靈敏度和定量分析的優點，被應用于細胞色素c的檢測。然而，電化學技術依賴于昂貴的酶或金屬納米粒子進行信號放大。此外，由于它們在電極/溶液界面處的電子轉移速率較低，需要復雜繁瑣的電極預處理和修飾過程。為了克服這些不足，需要發展一些細胞色素c檢測的新方法，例如探索細胞色素c可能存在的生物活性，通過檢測其底物分子而實現對細胞色素c的檢測。有研究表明，細胞色素c的血紅素輔基在結構上與過氧化物酶的相似(均含有與卟啉配位的Fe(III)和一個或兩個軸向配體)，因而具有類過氧化物酶活性。實際上，血紅素的類過氧化物酶活性已被應用于凝膠染色和比色檢測的顯色反應。這些檢測方法的顯色反應需要使用一種具有氧化還原活性的底物分子，名為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)。研究表明四甲基聯苯胺具有可逆的電化學活性。目前還沒有報道利用細胞色素c的過氧化氫酶活性進行原位電化學檢測。因此，可以開發出一種新型的微生物細胞色素c原位快速檢測方法具有重大意義。

發明內容

針對現有技術中所存在的不足，本發明的目的在于將細胞色素c固有的過氧化物酶活性與絲網印刷碳電極檢測技術相結合，構建一種原位的細胞色素c檢測方法。該方法具有特異性高，操作簡單，檢測迅速的優點。

本發明的目的在于提供一種細胞色素c檢測方法。

本發明的另一目的在于提供一種細胞色素c檢測試劑盒。

本發明所采取的技術方案是：

一種檢測細胞色素c的試劑盒，由洗滌緩沖液、絲網印刷碳電極、過氧化氫溶液、檢測

緩沖液和四甲基聯苯胺粉末制成。

進一步的，所述的洗滌緩沖液是0.01M～0.03M、pH 5.4～9.4的磷酸鹽緩沖液。

進一步的，所述的檢測緩沖液是0.1M～0.3M、pH 3.0～7.0的磷酸檸檬酸緩沖液。

一種檢測細胞色素c的檢測方法，包含以下步驟：

1)將待測微生物細胞液滴加到絲網印刷碳電極的工作電極表面，干燥，制成微生物修飾的絲網印刷碳電極；

2)將四甲基聯苯胺溶液滴加到微生物修飾的絲網印刷碳電極，反應至11分鐘時，用儀器進行電化學反應檢測，檢測其產生的電流強度；

3)根據電流強度分析判斷待測細胞中是否含有細胞色素c。

進一步的，步驟1)所述的微生物細胞液由微生物細胞和PBS緩沖液組成。

進一步的，步驟1)所述的干燥溫度為18～27℃。

進一步的，步驟1)所述的干燥時間為60～120min。

進一步的，步驟2)所述儀器為電化學工作站。

進一步的，步驟2)中，進行電化學反應檢測的電壓為-0.30V～-0.10V。