[發明專利]一種有效提取互葉白千層基因組DNA的方法

在審

• 申請號: 201810332394.9
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108410857A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 鄧紫宇;唐慶蘭;陳健波;劉媛;盧翠香;郭東強;李昌榮;任世奇;項東云;周維;伍琪;梁忠云
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區林業科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 盧穎

本發明提供了一種有效提取互葉白千層基因組DNA的方法，其包括以下步驟：（1）用液氮研磨樣品至粉末狀后移至離心管，加入常規預熱的DNA提取緩沖液，混勻后于65℃水浴30min；（2）取出離心管冷卻至室溫，加入氯仿與異戊醇混合液，混勻后離心分離；（3）取上清液，加入氯仿，混勻后離心分離；（4）取上清液，加入常規預冷的無水乙醇，混勻后在?20℃下靜置30min后離心分離，棄上清液；（5）用體積濃度75%乙醇清洗沉淀，室溫下干燥并加入DNA溶解緩沖液，置于?20℃保存備用。本方法能有效、快速地提取出純度高、適用于PCR檢測的互葉白千層基因組DNA，并且在提取過程中減少有毒藥品的使用。

技術領域

本發明屬于植物DNA提取技術領域，具體涉及互葉白千層的基因組DNA提取方法。

背景技術

互葉白千層（Melaleucaalternifolia）是桃金娘科（Myrlaceaca）白千層屬（Melaleuca）常綠灌木至小喬木樹種，自然分布于澳大利亞東北部的昆士蘭州和新南威爾士州北部。互葉白千層新鮮枝葉可提取精油，殺菌效果佳，廣泛應用于食品、制藥、香料等行業。

互葉白千層精油根據組分不同分為三種不同生化類型。根據不同的利用目的，選擇引種不同生化類型的互葉白千層可避免不必要的經濟損失。但是不同生化類型互葉白千層表型特征區分困難，化學分析工藝復雜，所以目前普遍采用具有快速、準確特點的分子生物技術來鑒定植物的品種。其中PCR技術是分子生物學基本技術，是開展植物品種鑒定的基礎，而高質量DNA的提取是進行PCR檢測的前提，所以采用合適的方法提取互葉白千層基因組DNA對于它的品種鑒定尤為重要。

在研究植物DNA提取方法時需要注意的是一種植物DNA提取方法往往不能很好的應用于不同種類的植物DNA的提取。其原因是植物除了含有蛋白質、糖類、脂肪等主要物質外，還有一些存在于植物體內，雖然與植物的生長發育無直接關系、但卻對植物適應不良環境或抵御病原物侵害以及植物的代謝調控等都有重要作用的有機物。這一類物質被稱為次生物質，其種類繁雜，而且在植物體內合成和分解產生的次生代謝產物也是極其復雜，這使得不同植物之間的基因組DNA有較大的區別。因此DNA的提取方法也會有所區別。

目前，提取互葉白千層基因組DNA的方法還未見有報道，采用常規的SDS法和CTAB法提取互葉白千層基因組DNA時，所獲得的DNA質量差、用于PCR擴增的效果差，而采用試劑盒提取互葉白千層基因組DNA，成本高、DNA得率低。

發明內容

本發明針對現有技術不足，提供了一種有效提取互葉白千層基因組DNA的方法，該方法可以提取適合分子鑒定的高質量高濃度的互葉白千層基因組DNA，并且還具有毒性小、易操作、成本低的優點。

為了實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種有效提取互葉白千層基因組DNA的方法，包括以下步驟：

（1) 用液氮研磨互葉白千層新鮮葉樣至粉末狀，迅速移至離心管，加入常規預熱的DNA提取緩沖液，混勻后于65℃水浴30min；

（2) 取出離心管冷卻至室溫，加入與DNA提取緩沖液等體積的氯仿與異戊醇混合液，其混合液體積比為：氯仿:異戊醇=24:1，混勻后于12000r/min離心10min；

（3）取上清液置于新的離心管，加入與上清液等體積的氯仿，混勻后于12000 r/min離心10min；

（4）取上清液置于新的離心管，加入上清液1.5倍體積的常規預冷的無水乙醇，混勻后于-20℃靜置30min，12000 r/min離心10min，棄上清液；

（5）用體積濃度75%乙醇清洗沉淀2次，室溫下干燥5min，加入DNA溶解緩沖液，置于-20℃保存備用。