[發明專利]一種分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201810313711.2
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108424871B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 王緒德;周亞鳳;畢利軍;周盈;張曉麗
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;C12R1/34
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 王國標

1.一種分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌的構建方法，包括步驟：

1).構建質粒pMHS-NrtR_ms：

1-1).以恥垢分枝桿菌mc²155基因組DNA為模板、SEQ ID No.1～4所示的引物對進行PCR擴增，得到如SEQ ID No.5和6所示的DNA片段，電泳分離后經Van91I限制性內切酶酶切備用；

1-2).將含有pMHS質粒的大腸桿菌DH5α菌株擴大培養，然后收集菌體，抽提質粒，質粒經Van91I限制性內切酶酶切后電泳分離，回收1600bp區間和3600bp區間的DNA片段；

1-3).將步驟1-1)與1-2)所獲得的DNA片段經T4 DNA連接酶16℃反應過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，擴大培養，抽提質粒后獲得質粒pMHS-NrtR_ms；

2).構建質粒pHAGE-NrtR_ms：

2-1).分別擴大培養含有質粒pHAGE和質粒pMHS-NrtR_ms的大腸桿菌DH5α菌株，抽提質粒，兩個質粒經PacI限制性內切酶線性化后再用T4 DNA連接酶16℃反應過夜，連接產物使用包裝試劑盒包裝并轉化大腸桿菌HB101感受態細胞，抽提質粒后獲得質粒pHAGE-NrtR_ms；

3).制備重組TM4噬菌體：

3-1).擴大培養恥垢分枝桿菌mc²155，振蕩培養至對數生長期，離心收集菌體，用預冷的10％無菌甘油洗滌菌體，然后加入預冷的10％的甘油重懸菌體，-80℃凍存備用；

3-2).將質粒pHAGE-NrtR_ms轉入恥垢分枝桿菌mc²155電轉感受態細胞中，冰上孵育10min，然后電擊轉化，轉化后加入7H9液體培養基，37℃培養箱孵育過夜，將37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混勻并傾倒平鋪在7H10固體平板上，平板置30℃培養箱培養2-3天，獲得重組TM4噬菌體；

4).構建nrtR_ms基因缺失菌株恥垢分枝桿菌mc²100：

4-1)7H9液體培養基培養恥垢分枝桿菌mc²155至對數生長期，離心收集菌體，用MPbuffer洗滌離心獲得的菌體，然后用MP buffer重懸菌體，將重懸的恥垢分枝桿菌mc²155與滴度為10¹⁰PFU的重組TM4噬菌體1:1體積混合后培養箱孵育，然后離心收集菌體棄上清后用7H9液體培養基重懸，放置培養箱孵育過夜，再次離心收集菌體棄上清，菌體涂布7H10固體平板培養，獲得分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌mc²100。

2.根據權利要求1所述的分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌的構建方法，其特征在于：步驟3)中收集菌體的離心條件為4℃，5000rpm離心10min；步驟4)中收集菌體的離心條件為6000rpm離心10min。

3.根據權利要求1所述的分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌的構建方法，其特征在于：步驟1-2)中的擴大培養是將菌株接種至含有150μg/mL潮霉素B的LB液體培養基，37℃過夜培養。

4.根據權利要求1所述的分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌的構建方法，其特征在于：步驟1-3)中的擴大培養是將菌株接種至含有150μg/mL潮霉素B的LB固體平板培養基，37℃過夜培養，然后挑取平板上長出的單克隆菌落接種至含有150μg/mL潮霉素B的LB液體培養基，37℃搖床200rpm震蕩過夜培養。

5.根據權利要求1所述的分泌煙酸的突變恥垢分枝桿菌的構建方法，其特征在于：步驟2-1)中質粒pHAGE以含有氨芐抗性的LB培養基擴大培養，質粒pMHS-NrtR_ms以含有潮霉素B抗性的LB培養基擴大培養。