[發(fā)明專利]一種生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)外源性分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810311363.5
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108330158A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 季小榮;朱曉軍;周瑋;陳曉蔚;鄭曉茜;周碧洋;王嘉慧
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/02
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 王珒

本發(fā)明公開了一種生鮮乳中β?內(nèi)酰胺酶內(nèi)外源性分析方法，屬于食品檢測領(lǐng)域。該方法包括以下步驟：1)檢測生鮮乳中β?內(nèi)酰胺酶，鑒別出陰性樣品和陽性樣品，篩選出陽性樣品；2)將步驟a)中的陽性樣品重新接種于β?內(nèi)酰胺酶陰性的滅菌乳培養(yǎng)，再次檢測β?內(nèi)酰胺酶，鑒別出陰性樣品和陽性樣品，將陰性樣品判定為β?內(nèi)酰胺酶外源性樣品；陽性樣品判定為β?內(nèi)酰胺酶外源性樣品。本發(fā)明的方法能有效鑒別生鮮乳中β?內(nèi)酰胺酶內(nèi)外源性，從而辨別樣品中的β?內(nèi)酰胺酶是由耐藥菌產(chǎn)生還是商家違法添加，可有效應(yīng)用于食品安全監(jiān)督抽檢，該方法操作簡單方便、成本低廉、利于推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶內(nèi)外源性分析方法。

背景技術(shù)

目前，牛乳中抗生素殘留問題已經(jīng)引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。我國農(nóng)業(yè)部2001年頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標準，該標準規(guī)定生鮮乳中抗生素“不得檢出”。然而由于β-內(nèi)酰胺酶可以選擇性地分解牛乳中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素，掩蓋抗生素痕跡，并且由于抗生素類藥物的濫用，已引起耐藥菌株的增加；因此β-內(nèi)酰胺酶的使用可引起耐藥菌株的增加已成為不容置疑的事實，有關(guān)數(shù)據(jù)也表明經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶分解后的抗生素分解產(chǎn)物可能對人體健康構(gòu)成潛在威脅。

常用的β-內(nèi)酰胺酶檢測法包括理化檢測法、微生物檢測法、免疫法檢測法、試劑盒檢測法以及試劑條檢測法。

理化檢測法是利用β-內(nèi)酰胺酶分子中的基因所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法和聯(lián)用技術(shù)等；理化檢測法準確性好，敏感性強，重現(xiàn)性好，但通常檢測程序較復(fù)雜，檢測費用較高。經(jīng)檢索，關(guān)于理化檢測方法現(xiàn)有技術(shù)也進行了改進，如中國專利申請?zhí)朇N200910062852.2，公開日為2010.12.29的申請案公開了一種β-內(nèi)酰胺酶的快速測定的方法。該方法將待測樣品，如奶液中含有的β-內(nèi)酰胺酶與其底物，如青霉素以兩組獨立的流動相在一反應(yīng)器進行混合并進行催化反應(yīng)，將其生物催化產(chǎn)生的熱量轉(zhuǎn)化成溫度的變化，并通過測量其溫度的相對變化來確定其待測物的成分、濃度或活性等。該β-內(nèi)酰胺酶測定儀為酶熱生物分析儀，能定量分析和定性分析液態(tài)樣品中的β-內(nèi)酰胺酶含量和活性。適合于食品分析中尤其是乳制品、飲料等中的β-內(nèi)酰胺酶的快速檢測(5分鐘/樣品)，并具有檢測價格低(約幾元人民幣/樣品)、操作簡便、無需對樣品進行預(yù)處理和很高的靈敏度和精度。

微生物法是在規(guī)定條件下選用適當(dāng)微生物測定某物質(zhì)含量的方法；微生物法中常用的一種方法為杯碟法，主要采用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株(藤黃微球菌)，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小，間接測定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。該檢測方法成本低廉、準確性好；然而對試驗要求比較嚴格，試驗條件也要求嚴密。

免疫法是依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)的基本特性而設(shè)計的檢測方法，操作簡單、速度快、特異性強，但操作過程復(fù)雜。如中國專利申請?zhí)?01310001684.2，公開日為2014.11.26的申請案公開了一種檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的雙抗體夾心法，該申請案應(yīng)用購于上海阿拉丁試劑公司的重組β-內(nèi)酰胺酶免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)過正常的免疫、細胞融合、篩選后得到15株β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體。15株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶(HRP)并進行兩兩配對。以JN2011-03、JN2011-04分別為包被抗體和酶標抗體，以β-內(nèi)酰胺酶為標準品建立了β-內(nèi)酰胺酶的夾心ELISA分析方法，LOD為1.22ng/mL，線性范圍為10～100 ng/mL。

試劑盒檢測法采用間接競爭法，利用β-內(nèi)酰胺酶可分解β-內(nèi)酰胺類抗生素的原理，通過配體-受體識別法快速測定與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)后殘留的青霉素G抗生素的含量。生鮮牛乳樣品中添加已知含量的β-內(nèi)酰胺類抗生素受體與樣品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶特異性配體蛋白結(jié)合反應(yīng)，殘余的β-內(nèi)酰胺酶與載體上包被有β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合反應(yīng)，β-內(nèi)酰胺類抗生素被分解后顯色，與標準溶液色帶對照定性。但是單個樣品檢測價格昂貴，較適用于少量樣品的現(xiàn)場操作及快速檢測。