[發(fā)明專利]一種Cre/loxP基因刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810310003.3
• 申請(qǐng)日: 2018-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN108504682A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅克明;楊晨;葛佳;竇立雯;汪麗君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/10;A01H6/20
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 康海燕

本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種Cre/loxP基因刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用。該系統(tǒng)包括植物表達(dá)載體I和II；植物表達(dá)載體I包括兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，所述的同向loxP位點(diǎn)間依次插入有目標(biāo)基因I的表達(dá)元件和NCre的表達(dá)元件；植物表達(dá)載體II包括兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，所述的同向loxP位點(diǎn)間插入有CCre的表達(dá)元件。其能夠使外源基因在轉(zhuǎn)基因作物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段正常表達(dá)，能保持外源基因所帶來(lái)的優(yōu)良性狀，轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，發(fā)生對(duì)外源基因的刪除，從而收獲無(wú)外源基因的果實(shí)和種子，消除轉(zhuǎn)基因安全隱患；其還具有高效性和簡(jiǎn)潔性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種Cre/loxP基因刪除系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)已成為進(jìn)行基因功能研究和植物遺傳改良的重要工具(王根平等，2016)。植物基因工程技術(shù)，也被稱為遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是指利用重組DNA技術(shù)在體外有目的的對(duì)外源或者內(nèi)源基因進(jìn)行改造和重新組合，借助生物、物理或化學(xué)手段將重組DNA插入到受體植物細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)和遺傳，從而達(dá)到賦予受體植物新性狀的目的(黃珊等，2012)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，其已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的生產(chǎn)及改良中，且越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物已經(jīng)向商品化發(fā)展(Griffiths AJF et al.,2005)。

盡管人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的接受度越來(lái)越高，但事實(shí)上轉(zhuǎn)基因植物的基因組上存在的選擇標(biāo)記基因(通常是抗生素基因或抗除草劑基因)仍然是監(jiān)管機(jī)構(gòu)和公眾所關(guān)注的焦點(diǎn)，具有很大爭(zhēng)議。這些爭(zhēng)議多數(shù)是圍繞轉(zhuǎn)基因植物對(duì)食品安全和環(huán)境安全兩方面的潛在影響展開的(Yau YY et al.,2012)。因此，如何才能在利用好轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)又能解決轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問(wèn)題，消除公眾的憂慮，就成為了現(xiàn)如今亟待解決的問(wèn)題。目前，已經(jīng)報(bào)道的解決轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題的技術(shù)有很多種，根據(jù)其原理和目的大致可分為以下幾類：防止基因逃逸的方法，安全標(biāo)記基因法，基因定點(diǎn)修飾技術(shù)，標(biāo)記基因刪除技術(shù)。而在標(biāo)記基因剔除法中，運(yùn)用最多的就是Cre/LoxP系統(tǒng)。

自1988年，Sauer等首次在小鼠細(xì)胞內(nèi)利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了loxP位點(diǎn)之間基因片段的刪除(Sauer B et al.,1987)后，Cre/loxP重組酶系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域，包括動(dòng)物、植物和酵母。羅克明等建立了能高效且徹底刪除外源基因的刪除系統(tǒng)“Gene-deletor”，但是該系統(tǒng)的局限在于其不能用于雜交體系。為了能將該系統(tǒng)運(yùn)用于雜交作物當(dāng)中，將重組酶進(jìn)行拆分成為解決這個(gè)問(wèn)題的主要辦法。葛佳等根據(jù)Cre重組酶的結(jié)構(gòu)，選取了五個(gè)拆分位點(diǎn)，并且都用內(nèi)含肽Intein介導(dǎo)，通過(guò)比較拆分后的重組活性選出了最佳的拆分位點(diǎn)。將拆分后的無(wú)活性的Cre重組酶片段分別構(gòu)建到兩個(gè)載體中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因擬南芥，并進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了在866位點(diǎn)拆分重組酶Cre，并通過(guò)Intein介導(dǎo)拆分后的片段在擬南芥雜交系統(tǒng)中可恢復(fù)重組活性，但雜交后的擬南芥種子中仍存在外源基因。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題本發(fā)明提供一種Cre/loxP基因刪除系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠高效刪除雜交作物種子中的外源基因。

一種Cre/loxP基因刪除系統(tǒng)，其特征在于，包括植物表達(dá)載體I和II；植物表達(dá)載體I包括兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，所述的同向loxP位點(diǎn)間依次插入有目標(biāo)基因I的表達(dá)元件和NCre的表達(dá)元件，所述NCre的基因序列如SEQ ID No.1所示；植物表達(dá)載體II包括兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，所述的同向loxP位點(diǎn)間插入有CCre的表達(dá)元件，所述CCre的基因序列如SEQID No.2所示。

進(jìn)一步的，上述植物表達(dá)載體II的兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)間還插入有目標(biāo)基因II的表達(dá)元件，該表達(dá)元件位于CCre表達(dá)元件之前。

進(jìn)一步的，所述NCre的表達(dá)元件包括啟動(dòng)子、NCre基因、內(nèi)含肽基因In和終止子，所述啟動(dòng)子為花粉特異性啟動(dòng)子或胚珠特異性啟動(dòng)子，所述內(nèi)含肽基因In的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。