[發(fā)明專利]一種PEG修飾膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810306747.8
• 申請日: 2018-04-08
• 公開（公告）號: CN108588044A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅維曉;魏海明;王美麗;胡曉飛
• 申請（專利權(quán)）人: 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N9/18
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本發(fā)明涉及一種PEG修飾膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶的制備方法，屬于臨床體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，其基本步驟為首先配置緩沖液，然后加入對氨基苯磺酸和AEO?9兩種物質(zhì)作為激活劑，然后加入載體PEG20000（sigma），再加入保護劑以及乳化劑和離子物質(zhì)攪拌均勻后，依次加入膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶，慢中速攪拌10分鐘，然后使用低轉(zhuǎn)速離心機離心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修飾酶。配方組成成分：PIEPES、對氨基苯磺酸、AEO?9、PEG20000、保護劑、乳化劑、離子物質(zhì)、膽固醇氧化酶、膽固醇脂酶、MIT，本方法操作簡單、成本低，與PEG修飾酶法檢測高密度脂蛋白膽固醇具有良好的兼容性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PEG修飾膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶的制備方法，屬于臨床體外檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

PEG修飾酶法檢測血清高密度脂蛋白膽固醇，由1995年Sugiuchi首先提出，屬于均相法檢測血高密度脂蛋白膽固醇的一種重要的方法，其方法的反應(yīng)原理為試劑1中硫酸α-環(huán)糊精 、硫酸葡聚糖與標本中的LDL、VLDL及CM形成水溶性復(fù)合物。試劑 2 中PEG修飾酶系對 HDL發(fā)生反應(yīng)，從而達到檢測目的。本法原理著重點在于:①硫酸α-環(huán)糊精對富含apoB的LDL組分產(chǎn)生一種屏蔽作用；②PEG修飾酶中的PEG分子產(chǎn)生空間位阻,不利于大分子底物與酶接觸,而又不影響小分子的HDL與酶發(fā)生酶促反應(yīng)；③試劑2中的表面活性劑在不影響硫酸α-環(huán)糊精-LDL復(fù)合物的基礎(chǔ)上能使HDL快速充分溶解。上述三點充分保證HDL 測定的特異性和準確性。本法試劑非常優(yōu)良，與CDC指定的比較方法具有非常好的相關(guān)性，本法能夠?qū)崿F(xiàn)對HDL充分、快速反應(yīng) ,對LDL的非特異性反應(yīng)極少，抗干擾能力較強，結(jié)果較準確。

但因技術(shù)難度較大 ,國內(nèi)尚無產(chǎn)品問世 ，技術(shù)問題主要存在于修飾酶的合成與表面活性劑的篩選，其中最難以控制的就是PEG修飾酶的制備，Sugiuchi建立的方法為首先將PEG6000使用N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺（DCCI）進行活化，將膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶，加入到0.1mol/L的HEPES PH=8.5的緩沖液，溶解完全后，將活化的PEG6000加入到酶溶液中，令PEG6000與酶通過共價鍵結(jié)合在一起 ，至少需要30分鐘的時間，然后將PEG6000使用濾網(wǎng)將其過濾掉，然后使用HPLC方法進行檢測結(jié)合后的酶的活性，作者通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，本方法存在以下幾個問題：①在PEG6000與酶結(jié)合的過程中，即使是PEG6000非常過量，但是也有少量的酶類沒有被結(jié)合，這就在使用的時候為修飾酶的特異性增加了難度；②所激活PEG6000的兩種物質(zhì)，如果清理不當，會對后面HDL-C的檢測造成影響，③如果沒有結(jié)合酶的PEG過濾不夠徹底，則會造成結(jié)果HDL-C的檢測不準確，④修飾酶的過程過于繁雜，需要很高的技術(shù)和實驗水平，修飾酶的獲取成本高。

因此基于以上的條件制約，影響了PEG-修飾酶法這種非常優(yōu)良的檢測方法的普及和推廣，因此根據(jù)這些問題，發(fā)明了一種PEG修飾膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種PEG修飾膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶的制備方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

1）基本原理：以PEG20000為載體，在激活劑以及離子物質(zhì)存在的情況下，使膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶與PEG20000之間形成離子鍵，以獲取具有對脂蛋白具有選擇性的PEG修飾酶；

2)基本步驟：

首先配置緩沖液，然后加入對氨基苯磺酸和AEO-9兩種物質(zhì)作為激活劑，然后加入載體PEG20000（sigma），再加入保護劑以及乳化劑和離子物質(zhì)攪拌均勻后，依次加入膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶，慢中速攪拌10分鐘，然后使用低轉(zhuǎn)速離心機離心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修飾酶；

3)配方組成成分：