[發明專利]利用Crispr技術敲除Cosmc基因構建的O-型糖基化異常的結腸癌細胞系

在審

• 申請號: 201810299953.0
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108467874A
• 公開（公告）日: 2018-08-31
• 發明（設計）人: 安廣宇;溫韜;劉喆;劉健
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;C12N15/867
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

本發明公開了利用Crispr技術敲除Cosmc基因構建的O?型糖基化異常的結腸癌細胞系。本發明的O?型糖基化異常的結腸癌細胞系的制備方法包括如下步驟：利用CRISPR/Cas9系統對結腸癌細胞基因組中的Cosmc基因進行編輯，進而使所述T?synthase功能喪失，得到O?型糖基化異常的結腸癌細胞系。本發明使用慢病毒做中間媒介敲除結腸癌細胞內Cosmc基因，代替了質粒直接轉化細胞，更高效地發揮Crispr/Cas9的敲除作用。為研究異常的O?型糖基化對于結直腸癌發生發展的影響奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及利用Crispr/Cas9系統構建的敲除Cosmc基因的結腸癌細胞系，特別涉及利用Crispr/Cas9系統靶向編輯Cosmc基因制備O-型糖基化異常的HCT116和SW840結腸癌細胞系的方法。

背景技術

糖鏈的修飾是重要的蛋白質翻譯后修飾，黏蛋白O型糖基化是其中重要的類型之一。黏蛋白型O-聚糖通過一個在高爾基體發生的連續糖基轉移作用合成，而合成的過程由一套糖基轉移酶催化。T-synthase是合成O-聚糖核心1的唯一糖基轉移酶，它主要的功能是將半乳糖添加到Tn抗原糖鏈上。但是在人體和其他脊椎動物中有活性的T-synthase的形成需要一個重要的伴侶分子Cosmc，它幫助T-synthase折疊形成正確的蛋白質三級結構。Cosmc功能喪失將直接導致T-synthase失活，其結果是機體細胞只能合成Tn抗原以及唾液酸化的sTn抗原。

已有研究發現在結直腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌組織中高表達Tn抗原，Tn抗原的暴露于腫瘤的發生發展有密切聯系。目前大部分結腸癌細胞系均為O-型糖基化正常的細胞系，為了研究O-型糖基化在腫瘤中的功能與機制，需要在體外構建可穩定遺傳的異常型O-型糖基化細胞系。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種O-型糖基化異常的結腸癌細胞系的制備方法。

本發明提供的O-型糖基化異常的結腸癌細胞系的制備方法包括如下步驟：利用CRISPR/Cas9系統對結腸癌細胞基因組中的Cosmc基因進行編輯，進而使所述T-synthase功能喪失，得到O-型糖基化異常的結腸癌細胞系。

上述方法中，所述CRISPR/Cas9系統包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列具體可為Cosmc基因的第55-74位。

上述方法中，所述編輯的方法為向所述結腸癌細胞中導入Cosmc基因編輯的慢病毒載體；所述Cosmc基因編輯的慢病毒載體含有所述sgRNA的編碼基因和Cas9蛋白的編碼基因。

進一步的，所述Cosmc基因編輯的慢病毒載體為將雙鏈DNA分子插入慢病毒表達載體的酶切位點間得到的載體；所述雙鏈DNA分子是將單鏈DNA分子甲和單鏈DNA分子乙退火制備得到的；

所述單鏈DNA分子甲的核苷酸序列如序列1所示；

所述單鏈DNA分子乙的核苷酸序列如序列2所示。

更進一步的，所述Cosmc基因編輯的慢病毒載體為將所述雙鏈DNA分子插入LentiCRISPRV2載體的BsmBI酶切位點間得到的載體。

上述方法中，所述結腸癌細胞為結腸癌細胞HCT116或結腸癌細胞SW840。

本發明的另一個目的是提供按照上述方法制備得到的O-型糖基化異常的結腸癌細胞系。

本發明還有一個目的是提供上述Cosmc基因編輯的慢病毒載體。

上述Cosmc基因編輯的慢病毒載體在制備O-型糖基化異常的結腸癌細胞系中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述方法或細胞系或應用中，所述O-型糖基化異常為T-synthase控制的O-型聚糖鏈延伸異常。