[發明專利]一種天然組織來源的髓核脫細胞材料的制備方法

有效

• 申請號: 201810294591.6
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108310466B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 林賢豐;許家齊;方向前;范順武;王晟毓
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明公開了一種天然組織來源的髓核脫細胞材料的制備方法，將哺乳動物任意大小的髓核組織經含蛋白酶抑制劑的PBS、含NaCl的PBS緩沖液、含Triton X的PBS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液、含DNA酶的PBS緩沖液處理，獲得天然組織來源的髓核脫細胞材料。本發明能對組織上的細胞進行完全去細胞化處理，且條件溫和、無ECM損害、快速穩定。所得的材料，不僅最大限度的模擬了天然的髓核結構、較好的保留了細胞外基質成分、還具有極低的免疫原性等優點，可用于修復臨床上各類病因造成的椎間盤損傷、髓核退變相關疾病。

技術領域

本發明主要用于椎間盤髓核的修復及再生的醫學領域。具體涉及一種天然組織來源的髓核脫細胞材料的制備方法。

背景技術

椎間盤退變是導致腰椎間盤突出的主要因素，給社會保障和經濟帶來巨大的負擔。目前針對腰椎間盤突出的手術方式主要是椎體融合術，其并不能恢復正常椎間盤的功能。組織工程則力主恢復正常的椎間盤生理結構和力學功能，為未來椎間盤病變的治愈提供了一種可能的方式。椎間盤退變的組織學特征是髓核含水量降低，I型膠原增加而II型膠原減少，同時糖胺聚糖含量也降低，導致髓核缺乏彈性，容易引起椎間盤突出。因此，消除髓核退變，再生正常髓核，是組織工程治療椎間盤退變的一種重要策略。目前，在組織工程領域，相比人工髓核材料，脫細胞材料在去除細胞的同時保留了原組織的三維結構，生長因子和力學特性。這些共同構成了髓核細胞生長的微環境，提供了機體干細胞分化為髓核細胞的信號。已有實驗證明，脫細胞髓核材料可以誘導人來源的脂肪干細胞分化為髓核細胞，并成功分泌出髓核相關的糖胺聚糖和膠原II細胞外基質。這些預示了脫細胞髓核材料有足夠的前景作為一種退變髓核再生的替代材料。

脫細胞技術是獲得脫細胞材料的手段。其最重要評價指標是能夠徹底地去除組織中的細胞，同時完好地保留細胞外基質，并且在脫細胞處理過程后不殘留毒性物質。目前性能優良的髓核脫細胞支架還未見報道。因此本發明通過創新的脫細胞技術制備了一種天然的髓核脫細胞支架，在去除細胞的同時，最大化模擬了天然的髓核結構，證明了該支架具有極低的免疫原性，較好的保留了天然髓核的細胞外基質組分，并且證實該支架在體內能很好的再生退變髓核，在椎間盤退變再生組織工程中有極大的意義。

發明內容

本發明目的在于填補現有技術中，尚無脫細胞髓核支架制備的報道，提供一種具有極低免疫原性的，較好保留細胞外基質組分的，并能促進髓核再生的脫細胞髓核支架的制備方法。

一種天然哺乳動物或人組織來源的髓核脫細胞材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)取宰殺12h以內任意哺乳動物的胸5到腰6脊椎，用刀分離出椎間盤，然后切開纖維環取出髓核。用含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液漂洗髓核3次，每次30min，去除血液，貼附的脂肪碎片和其他雜質。

(2)在含10K IU/ml蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，低溫(4℃)搖床100rpm震蕩24-48小時；然后用液氮凍融3個循環(-80℃/37℃)

(3)在含NaCl的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫(4℃)搖床100rpm震蕩24-48小時；

(4)在含Triton X的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫(4℃)搖床100rpm震蕩24-48小時；

(5)在含SDS的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫(4℃)搖床100rpm震蕩24-48小時；

(6)在含DNA酶的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，37℃搖床120rpm震蕩12-24小時；

步驟(2)-(6)中，每個步驟完成后均用生理鹽水沖洗8小時。

作為優選，所述含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，蛋白酶抑制劑濃度為10-20K IU/ml；

作為優選，所述的含NaCl的PBS緩沖液為濃度1M-1.5M的NaCl的PBS緩沖液；