[發(fā)明專利]一種準確簡便鑒定沼澤山雀性別的引物及鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810288034.3
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108315443A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬冬梅;張雷;王娟;張海旺;王偉榮;崇凌志;韓梅
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發(fā)明涉及一種準確簡便鑒定沼澤山雀性別的引物及鑒定方法。提取沼澤山雀的基因組總DNA；2)以基因組總DNA為模板，利用引物2550F和RevP1進行PCR擴增反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn)物；將獲得擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Dolphin?Doc凝膠成像儀進行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷沼澤山雀的性別：雌性為兩條帶長度分別為447bp和635bp，雄性為一條帶長度為447bp。本發(fā)明利用對CHD基因在W,Z染色體上的特異序列的擴增所產(chǎn)生的不同帶型來判斷沼澤山雀的性別，無需特殊儀器要求，鑒定方法簡便易行，快速準確，可重復(fù)性強，為今后對沼澤山雀分子生物學(xué)領(lǐng)域進一步深入探究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種準確簡便的鑒定沼澤山雀性別的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

性別是鳥類最重要的特征之一，雌雄個體的鳥類往往在生理，行為等方面具有差別。鳥類的性別鑒定，特別是性別的早期鑒定對鳥類的遺傳疾病防治，種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)分析等有著非常重要的意義。全世界約有50％的鳥類為雌雄同型鳥，很難通過外部特征進行性別鑒定。通過外科手術(shù)(剖腹和鏡檢)直接觀察生殖腺進行鑒定，不適用于體積較小的鳥類，而且均會對鳥類造成傷害甚至導(dǎo)致不育。細胞水平的性別鑒定主要是對W染色體進行觀察，雌性的性染色體一條大(Z)，一條小(W)，而雄性個體為兩條較大的(Z)染色體，但是在實際應(yīng)用中存在一定的困難，鳥類的染色體數(shù)量大，而且對染色體的大小劃分容易造成人為差異。

沼澤山雀是一種單態(tài)性鳥，無論在幼鳥還是成鳥時期，都很難從外觀形態(tài)或其他行為上區(qū)分雌雄。因此，開發(fā)一種準確簡便的沼澤山雀性別鑒定方法，對后續(xù)的分子研究極為重要。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種準確簡便的，可操作性強的沼澤山雀性別鑒定方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種準確簡便鑒定沼澤山雀性別的引物，所述的引物的DNA序列為：

2550F 5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’

RevP1 5’-TGAGGAAACAAGCACTGGAC-3’

一種準確簡便鑒定沼澤山雀性別的方法，包括如下步驟：

1)提取沼澤山雀的基因組總DNA；

2)以基因組總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR擴增反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn)物；

PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃/7min；94℃/30s，58℃/30s，72℃/45s，30個循環(huán)；72℃/7min，4℃保存。

3)將獲得擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Dolphin-Doc凝膠成像儀進行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷沼澤山雀的性別。帶型判斷標準為：雌性為兩條帶，雄性為一條帶，即雌性為兩條帶，長度分別為447bp和635bp，雄性為一條帶，長度為447bp。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的方法，樣本簡單(如羽毛、血液樣本)、采樣量低、可非損傷性取樣、雙陽性檢驗。本發(fā)明的方法主要是基因水平的性別鑒定技術(shù)，使得鑒定結(jié)果更為可靠，可廣泛應(yīng)用于鳥類的性別鑒定。自染色體螺旋蛋白基因(Chromobox-helicase-DNA binding gene,CHD)是鳥類性染色體上同源區(qū)的基因，該基因在演化的過程中相對保守。在Z和W染色體上各有一個拷貝，該拷貝外顯子序列相似，但內(nèi)含子序列長度存在差異。因此，本發(fā)明根據(jù)內(nèi)含子序列兩側(cè)的側(cè)翼序列設(shè)計引物，在PCR的結(jié)果中，雄性可以擴增出1個條帶，雌性可以擴增出兩個條帶，因而，可以根據(jù)PCR電泳結(jié)果中的條帶數(shù)判定鳥類的性別。本發(fā)明利用對CHD基因在W,Z染色體上的特異序列的擴增所產(chǎn)生的不同帶型來判斷沼澤山雀的性別，無需特殊儀器要求，鑒定方法簡便易行，快速準確，可重復(fù)性強，為今后對沼澤山雀分子生物學(xué)領(lǐng)域進一步深入探究奠定了基礎(chǔ)。