[發(fā)明專利]從犬的臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810278280.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108486050B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小武;遲大明;朱春穎;郭春明;許曉椿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津博雅秀巖生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A61K35/28;A61P19/02;A61P19/08;A61P21/00;A61P19/04;A61P25/00;A61P37/02;A61P27/02;A61P1/16;A61P13/12;A61P3/10;A61P1/00;A61P5/14
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1.從犬的臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)消毒和清洗：用消毒液對(duì)犬的臍帶組織表面進(jìn)行消毒，將臍帶剪開(kāi)，平鋪，通過(guò)PBS緩沖液清洗臍帶組織，以減少臍帶組織上的紅細(xì)胞；所述PBS緩沖液是磷酸的鈉鹽和/或鉀鹽配制的，其pH為5.0-8.0；

(2)消化處理：將步驟(1)得到的臍帶組織剪成組織塊，將組織塊放入消化酶溶液中，消化處理0.5-3小時(shí)，過(guò)濾清除組織塊后，加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基以終止消化，然后對(duì)消化得到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞清洗，最終獲得細(xì)胞懸液；

(3)細(xì)胞培養(yǎng)：將步驟(2)得到的細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)容器，再將培養(yǎng)容器放進(jìn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第2-7天時(shí)將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，補(bǔ)加適量間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在第8-11天時(shí)將培養(yǎng)容器從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行第一次全換液，繼續(xù)培養(yǎng)；往后每1-3天進(jìn)行一次全換液；

(4)細(xì)胞傳代：當(dāng)培養(yǎng)容器中的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到40%-70%以后，利用添加了0.05%w/v的1,2-丙二醇的消化酶TrypLE? Express將貼壁細(xì)胞脫離容器底部，離心，抽走上清液，加入充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，再接種于培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，此后每1-3天換液一次，直至融合率達(dá)到70-90%后，即得P1代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；接著照上述培養(yǎng)方法進(jìn)行必要的傳代；任選的

(5)凍存：將步驟(4)所得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中添加細(xì)胞凍存液于液氮中冷凍，備用；

其中：

所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin、84重量份的DMEM-F12、0.02%w/v甘氨酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(1)中所述PBS緩沖液是磷酸的鈉鹽和/或鉀鹽配制的，其pH為6.0-7.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(1)中所述PBS緩沖液是磷酸鈉鹽，其中磷酸根的濃度為0.025M，pH為6.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述細(xì)胞凍存液包含DMEM-F12、二甲基亞砜和人血白蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(2)中所述消化酶溶液是將0.05g-0.5g 的I型膠原酶加入50-500ml的DMEM-F12中，通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾得到的。

6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(2)中所述消化酶溶液是將0.1g的I型膠原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混勻，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾得到的。

7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)中，消化處理的時(shí)間為0.5-3小時(shí)，消化處理是在36-38℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。

8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)所述培養(yǎng)箱中CO₂濃度為3-7%。

9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)所述培養(yǎng)箱中CO₂濃度為5%，培養(yǎng)箱溫度控制在36-38℃范圍內(nèi)。