[發明專利]豬輪狀病毒VP融合蛋白重構體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810271984.5
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108359015B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 徐進平;姚帥
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C12N15/62;C12N1/21;A61K39/15;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種豬輪狀病毒VP融合蛋白重構體VP8-VP7-TAT，其特征在于：其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.權利要求1所述的融合蛋白重構體VP8-VP7-TAT對應的的核苷酸序列，其特征在于：編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種含有融合蛋白VP8-VP7-TAT基因的大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于：其分類命名：Escherichia coli BL21(DE3) (pGEX-VP8-VP7-TAT)，即大腸桿菌BL21(DE3) (pGEX-VP8-VP7-TAT)，保藏編號：CCTCC NO: 2018047。

4.權利要求1所述的融合蛋白VP8-VP7-TAT的制備方法，包括步驟如下：

1）、獲得含有VP8、VP7基因及TAT轉導肽基因的重組表達質粒pGEX-VP8-VP7-TAT：

人工合成重組基因VP8-VP7-TAT基因片段，其序列為SEQ ID NO.1所示，VP8-VP7-TAT基因片段和質粒載體pGEX-6p-1分別經EcoR I和Xho I酶切，瓊脂糖凝膠電泳，膠回收，最后將目的片段連接在pGEX-6p-1載體上，連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經鑒定，得到的陽性重組子即為含有VP8-VP7-TAT基因的大腸桿菌，即構建了質粒pGEX-VP8-VP7-TAT；

2）、大腸桿菌工程菌的制備：

將重組表達質粒pGEX-VP8-VP7-TAT轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3) 感受態細胞，得到的陽性轉化子經菌液PCR和基因測序鑒定為陽性的菌落即為能表達融合蛋白VP8-VP7-TAT的重組基因工程菌Escherichia coli BL21(DE3) (pGEX-VP8-VP7-TAT)，大腸桿菌BL21(DE3) (pGEX-VP8-VP7-TAT)，即E.coli BL21(DE3)（pGEX- VP8-VP7-TAT）；

3）、融合蛋白VP8-VP7-TAT的制備：

將重組基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3) (pGEX-VP8-VP7-TAT)的單菌落接種于含100μg/ml Amp的20ml LB液體培養基中，37℃搖床過夜培養10-12h；第二天，取1ml菌液轉接到100ml含100μg/ml Amp的LB液體培養基中，37℃搖床培養3h，到菌液OD值約為0.6時，加IPTG誘導劑至終濃度為0.5mM，于37℃搖床250rpm誘導表達4-5h； 將菌液4℃，12000rpm離心5min，棄上清，收集菌體；用適量PBS緩沖液洗滌菌體，并用加入適量溶菌酶的細胞裂解液重懸菌體，300W超聲破碎20min，8000rpm離心20min；破碎后的沉淀經8M尿素變性后4℃，8000rpm，離心10min，收集上清；按GST-Resin純化步驟純化融合蛋白VP8-VP7-TAT，得到純化的融合蛋白VP8-VP7-TAT之后，進行復性透析后，獲得具有生物學活性的基因工程融合蛋白VP8-VP7-TAT；融合蛋白VP8-VP7-TAT序列為SEQ ID NO.2 所示。

5.權利要求1所述的融合蛋白重構體VP8-VP7-TAT在制備預防或治療由豬輪狀病毒引起的仔豬腹瀉病藥物中的應用。