[發(fā)明專利]糞便宿主DNA甲基化檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810266872.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN108220286A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅海貝;王臣;趙然;馮俊;陳小鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海銳翌生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發(fā)明提出了提取糞便中宿主DNA的試劑組合物及利用其提取糞便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和對(duì)經(jīng)過甲基化的糞便宿主DNA進(jìn)行甲基化特異性PCR檢測(cè)的試劑盒及方法。所述試劑組合物包括：提供硫酸根離子的裂解液A；以及提供鈣離子的絮凝劑。利用本發(fā)明的試劑組合物能夠充分提取出糞便中的宿主DNA，且提取效率較好、宿主DNA純度較高，操作簡(jiǎn)便，適于規(guī)?；瘧?yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及糞便宿主DNA甲基化檢測(cè)方法。更具體地，本發(fā)明涉及提取糞便中宿主DNA的試劑組合物及利用其提取糞便中宿主DNA的方法、DNA甲基化的方法和對(duì)經(jīng)過甲基化的糞便宿主DNA進(jìn)行甲基化特異性PCR檢測(cè)的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

DNA甲基化(DNA methylation)是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是表觀遺傳修飾的重要組成部分。DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)，而DNA基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島與基因表達(dá)密切相關(guān)。由此，甲基化水平的檢測(cè)對(duì)于研究宿主的特定基因表達(dá)情況具有重要意義。于人類而言，DNA甲基化與癌癥關(guān)系巨大，一些基因的甲基化檢測(cè)已被廣泛用于癌癥的早期診斷中，如乳腺癌(p16ink4a、RARβ)、肺癌(p16、DAPK、APC)、卵巢癌(TUSC3)等。

糞便作為一種新的非損傷性來源的樣本，在動(dòng)物分子遺傳學(xué)、種群生態(tài)學(xué)和一些腸道疾病診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。糞便中含有許多具有遺傳信息的樣品，如腸道菌群DNA、食物殘?jiān)鼧悠稤NA、消化道脫落細(xì)胞DNA等。

然而，目前對(duì)糞便宿主DNA的檢測(cè)仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

脫落細(xì)胞是宿主遺傳變異信息分析的優(yōu)良載體，但由于其含量較低且糞便樣本中干擾物質(zhì)種類和含量較多，如多聚糖、膽鹽、膽酸、色素和粘液等，雖有很多商業(yè)化的試劑盒，但大多數(shù)只能進(jìn)行宏量腸道菌群DNA提取，對(duì)宿主細(xì)胞DNA效率極低，難以滿足后續(xù)分析，并且由于糞便宿主DNA樣本中干擾物質(zhì)通常難以完全去除，為微量宿主DNA基因甲基化的檢測(cè)進(jìn)一步增加了難度。

有鑒于此，發(fā)明人通過對(duì)提取糞便宿主DNA的試劑進(jìn)行優(yōu)化，尤其是絮凝劑的添加，從而有效去除糞便宿主DNA中雜質(zhì)、PCR抑制物等，提高糞便宿主DNA的提取效率。在甲基化過程中，通過添加λDNA作為轉(zhuǎn)化輔助因子，顯著降低甲基化過程中DNA損失，并顯著提高對(duì)于轉(zhuǎn)化后微量目標(biāo)基因片段的回收率。通過對(duì)甲基化的宿主DNA中目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。在擴(kuò)增過程中，選擇較佳的擴(kuò)增試劑及擴(kuò)增程序，從而提高擴(kuò)增效率，進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度。

為此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種提取糞便中宿主DNA的試劑組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑組合物包括：提供硫酸根離子的裂解液A；以及提供鈣離子的絮凝劑。

由于糞便樣本中宿主細(xì)胞DNA含量較少，且干擾物質(zhì)種類及含量較多，如多聚糖、膽鹽、膽酸、色素和粘液等，會(huì)導(dǎo)致DNA提取效果較差，且雜質(zhì)較多。進(jìn)而，發(fā)明人創(chuàng)造性地構(gòu)建絮凝體系，以去除糞便樣本中的干擾物質(zhì)。具體地，在裂解液A中提供硫酸根離子，其可以與后續(xù)加入的含有鈣離子的絮凝劑發(fā)生硫酸鈣沉淀反應(yīng)形成絮狀沉淀，同時(shí)可以沉淀多種顆粒物等干擾物，從而提高糞便宿主DNA的提取效率及純度。并且，利用該試劑組合物提取的操作簡(jiǎn)便，適于規(guī)模化應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述提取糞便中宿主DNA的試劑組合物還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述裂解液A中含有硫酸銨，所述絮凝劑為氯化鈣溶液。由此，通過構(gòu)建絮凝體系，沉淀多種顆粒物等干擾物質(zhì)，進(jìn)一步提高糞便宿主DNA的提取效率，且不影響后續(xù)DNA甲基化及PCR擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生。