[發明專利]一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶及其表達菌株與應用

在審

• 申請號: 201810259811.1
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108517329A
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 費輝;錢世超;吳振舉
• 申請（專利權）人: 杭州柏普泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N9/20;A23K20/189;C12R1/125
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 黃歡娣;邱啟旺

本發明公開了一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶及其表達菌株與應用，表達菌株的制備方法為：將脂肪酶基因連接至表達載體上，獲得重組質粒；所述脂肪酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；將重組質粒轉化入枯草芽孢桿菌中，挑選陽性克隆，獲得重組解脂耶氏酵母脂肪酶表達菌株。將表達菌株為發酵菌株進行液體發酵，制備重組解脂耶氏酵母脂肪酶，16小時培養后的活力達到為109.3U/mL。實現了飼料用脂肪酶的安全、穩定生產，在食品、能源、化工和醫藥等行業具有重要應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術與飼料行業領域，具體涉及一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶及其表達菌株與應用。

背景技術

脂肪酶(lipase)是一類典型的羧酸水解酶，因能催化水解、酯化、轉酯化等多種反應類型而廣泛應用于食品、醫藥、能源、環境等領域，但脂肪酶在飼料方面的應用開發相對其它飼用酶仍處于起步階段。以解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2為代表的飼用脂肪酶具有耐受腸胃環境、生物安全性好、pH及溫度性能優越等諸多飼用酶所需特點，具有很高的開發應用潛力。

飼用脂肪酶通過酶促生化反應，強化飼養動物的脂肪消化利用過程，在確保消化道酸性環境品質穩定的前提下，改善飼料中油脂消化吸收的限速步驟，解決高能營養物油脂的消化利用效率。其具體作用體現于：(1)外源性脂肪酶的添加有利于補充幼畜因消化機能發育不全所造成的內源性消化酶活性和分泌量的不足。成年動物的消化系統則因油脂消化利用更加有效而獲得減負；(2)通過生態地改善動物的消化吸收環境，既能提高飼養動物肉類品質，也能有效降低因油脂消化利用問題誘發多種疾病的發生概率。例如：添加脂肪酶可以減少動物因高脂肪消化不良而造成的營養性腹瀉，促進動物生長；(3)脂肪酶的加入可以減少油脂的添加量，節省配方空間，降低飼料成本；(4)脂肪酶添加使飼料原料的能量利用率最大化，減少集約化養殖中營養物質的排泄，對打造綠色生態養殖業具有重要意義。

枯草芽孢桿菌是需氧，易于培養，生長周期較短，廣泛存在于自然界中，無細胞毒性，易于分離純化，轉錄翻譯十分嚴格，不易產生錯誤，微生物研究中較為理想的模式菌株。枯草芽孢桿菌具有安全、無致病性等特性，被美國食品監督委員會成為GRAS(GenerallyRecognized as Safe)，又是益生菌。其次枯草芽孢菌細胞膜為單層，分泌的蛋白容易回收、純化。，操作簡單，并且能夠產生多種酶類分泌到細胞外；此外，枯草芽孢桿菌易于培養，對培養基成分要求不嚴格，克采用相對低廉培養基成分，有效的降低生產成本，質粒、噬菌體都可作為克隆載體，沒有明顯的密碼子偏好性，轉錄翻譯系統十分嚴密，可以避免錯誤折疊的蛋白質和包涵體，因而在發酵領域有較好的應用前景。

現有的技術可利用生物載體進行脂肪酶的生產，如閆金勇等利用畢赤酵母表達生產脂肪酶，如徐莉等利用轉化解脂耶氏酵母生產脂肪酶，然后發酵時間過長(大于72小時)，生產周期偏長。

發明內容

針對現有的技術的以上缺陷和改進需求，本發明提供一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶及其表達菌株，以實現減短飼料用脂肪酶的生產周期，降低生產的成本。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶表達菌株，由下述方法制得：

(1)將脂肪酶基因連接至表達載體上，獲得重組質粒；所述脂肪酶基因具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)將重組質粒轉化入枯草芽孢桿菌中，挑選陽性克隆，獲得重組解脂耶氏酵母脂肪酶表達菌株。

進一步地，所述載體為pHT43。所述枯草芽孢桿菌為WB800N。

第二方面，本發明提供了一種重組解脂耶氏酵母脂肪酶，以表達菌株為發酵菌株進行液體發酵，制備脂肪酶。