[發明專利]一種砂殼蟲的分離與培養技術

有效

• 申請號: 201810255574.1
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108485981B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 楊軍;王文平;任可欣
• 申請（專利權）人: 中國科學院城市環境研究所
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明建立了一項砂殼蟲的分離與培養技術，屬于微生物學領域。本發明的主要特征是能夠從自然水體中分離純化出砂殼蟲單個蟲體，進行室內傳代培養。本發明通過室內培養獲得大量的砂殼蟲個體，克服了砂殼蟲獲取在時間和空間上的限制，為深入系統的研究砂殼蟲提供了豐富的實驗材料。本方法簡單、高效、成本低、應用范圍廣。

技術領域

本發明屬于微生物學領域，具體為砂殼蟲(Difflugia)的分離與培養技術，能夠從自然水體中分離純化出砂殼蟲單個蟲體，進行傳代培養。

背景技術

有殼蟲(testate amoebae)是一類常見的自由生活單細胞真核生物，具有個體小、豐度高、多樣性高的特點，在陸地和水生生態系統物質循環和能量流動中起重要作用，對于維持生態平衡具有積極意義。砂殼蟲(Difflugia)是有殼蟲類群種類最多的一個屬。作為單細胞生物，砂殼蟲不僅是研究遺傳和進化的優良材料而且對環境生態變化反應敏感，能夠指示氣候、水文等生態因子的變化。近年來，隨著對砂殼蟲深入研究，建立一種砂殼蟲有效的分離與培養技術對進一步發現其價值和應用前景尤為重要。

目前，國內外仍缺少完整規范的砂殼蟲分離與培養技術，由于砂殼蟲對其生長環境存在一些獨特的需求，甚至只在高溫季節繁殖，使用常規培養技術對從野外分離個體進行室內純化培養，一般很難成功。因此，研發一種簡單有效、易操作的砂殼蟲分離與培養技術是非常有必要的。該技術克服了砂殼蟲獲取在時間和空間上的限制，為系統深入研究砂殼蟲提供了豐富的材料。

發明內容

本發明的目的是建立一種完整規范的砂殼蟲分離與培養的技術，通過單細胞分離和室內培養獲得大量的砂殼蟲個體。

本發明可適用于砂殼蟲屬種類，且可廣泛應用于不同的水體類型，包括河流、湖泊和水庫等生境。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：砂殼蟲樣品的野外采集、過濾富集、單細胞分離、傳代培養、物種鑒定。

本發明所述的技術方法具體包括如下步驟：

1)砂殼蟲的野外采集與富集：使用25#浮游生物網(一般為64μm孔徑，可根據蟲體的大小選擇浮游生物網的孔徑)在水體表層進行拖網10min，至少30-40次。每4-5次拖網收集一份富集樣品，轉移到無菌瓶中臨時儲存，并在4h內運回實驗室。

2)蟲體的分離、純化：將富集的砂殼蟲放入培養皿或凹玻片上，使用微吸管或移液槍(1-10μL)在倒置顯微鏡或解剖鏡下對砂殼蟲進行逐個挑取，放入超純水中浸泡5min左右、沖洗3-4次。

3)蟲體的饑餓處理：將分離純化的砂殼蟲蟲體放入裝有超純水的培養皿中，室溫條件下饑餓2-3天。

4)單細胞培養：將饑餓處理后的砂殼蟲蟲體轉移到預先添加IWS培養基的24孔板(無菌板)中，每個培養孔中接入單個蟲體，并使用斜生柵藻喂食，在25-30℃的恒溫光照培養箱中進行培養(光照周期，12:12h；光照強度，2000Lx)，一般7-10天轉移一次蟲體或者更換一次培養基。每日定期觀測砂殼蟲生長狀況。

IWS培養基的組成：使用孔徑0.2μm濾膜過濾的原位水(In situ water)；120℃高溫高壓滅菌的沙粒(Sterile sand)(直徑64μm,密度為1×10^5-7ind/L)；以斜生柵藻(Scenedesmus obliquus，密度為1×10⁸ind/L)喂食；原位水：沙粒：柵藻體積比為，40:2:1。

5)砂殼蟲的形態學鑒定：利用倒置顯微鏡對砂殼蟲的形態和運動特征進行觀察，包括殼體和殼口的形態、大小以及細胞核和偽足的形態。

權利要求書

本發明主要的優勢是：使用IWS培養基可從自然水體中分離出活的砂殼蟲，并在室內實現傳代培養。