[發明專利]葡萄霜霉病菌離體保存方法

在審

• 申請號: 201810252937.6
• 申請日: 2018-03-26
• 公開（公告）號: CN108485978A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 宋雙;姜彩鴿;張怡;王國珍;樊仲慶;張華普
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院植物保護研究所（寧夏植物病蟲害防治重點實驗室）
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/645
• 代理公司: 寧夏合天律師事務所 64103
• 代理人: 楊麗坤;孫彥虎

本發明公開一種霜霉病菌離體保存方法，是將葡萄霜霉病菌包埋于瓊脂粉中，然后在?80℃條件下進行保存，保存90d后回接葡萄健康葉片仍有致病性，還包括葡萄霜霉病菌的具體的保存處理方法及條件、保存后孢子囊致病性的測定等過程。本發明的方法是一種理想的、簡單有效的保存方法。

技術領域

本發明涉及病菌離體保存領域，尤其涉及一種葡萄霜霉病菌離體保存方法。

背景技術

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni)屬鞭毛菌亞門，卵菌綱，霜霉菌目，霜霉科，單軸霉屬。該病原菌為二倍體活體營養性專性寄生菌。無性階段的孢子囊為其繁殖體。有性階段產生卵孢子。

由于葡萄霜霉病菌是一種寄生性細菌，迄今為止在人工培養基上不能進行培養和保存，這給在不同時期、不同地點下研究該病菌帶來很大困擾。目前國內外有關專性寄生菌離體保存的報道很多。如Gill和Davidson報道，野豌豆霉病菌的孢子囊用保護劑進行處理后在-80℃中可保存一年，回接感病品種的葉片后，發病面積百分率仍可達到50％以上；Gulya等報道，向日葵等霜霉病菌的孢子囊可在液氮中保存4年以上，這種方法同樣也適用于P.parasitica和Pseudoperonospora Cubensis孢子囊的保存；Bromfield和Schmitt證明，煙草霜霉病菌的孢子囊用DMSO作為保護劑處理后，能在-180℃液氮中儲存25個月后，仍然對宿主有致病性；郝勇娟報道，古巴假霜霉菌的孢子囊在-30℃保存40d以內均浸染成功，超過50d失去浸染力；張艷菊認為，黃瓜霜霉病菌孢子囊體外保存的最佳條件為10％DMSO和5％脫脂奶混合液預先-20℃冷凍24h，然后置于-70℃冰箱，孢子囊可保存12個月后仍具有較高的致病性；杜興蘭等人報道，5％DMSO作為保護劑在-76℃保存葡萄霜霉菌240d以上，而使用25％甘油作為保護劑在-76℃保存5d后，活化后在寄主上回接，發病面積僅為4％，保存效果較差。

上述常用的孢子囊保護劑有二甲基亞砜和液氮等。二甲基亞砜存在一定的毒性作用，高揮發濃度可能導致頭痛和暈眩，能夠灼傷皮膚使皮膚有刺痛感；液氮是一種使人窒息的氣體，低溫會對人造成凍傷，不可與皮膚接觸；所以上述保護劑雖然常用但是也有各自的缺點。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種葡萄霜霉病菌離體保存方法，使用瓊脂粉作為保護劑，實驗室可就地取材，安全方便快捷。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種霜霉病菌離體保存方法，將離體的霜霉病菌包埋在瓊脂粉中后置于低于-20℃的環境保存。

最優的，置于-80℃的環境保存。

最優的，所述離體的霜霉病菌獲得的步驟為：采集生長良好且感染霜霉病的單斑病葉，沖洗掉病葉表面雜物和原有的霜霉病菌霉層，然后將病葉置于鋪有濕潤紗布或濾紙的容器內，葉片背面朝上，用浸濕的棉花包裹葉柄，用濾紙吸干病葉表面殘留的水珠，保鮮膜封住容器開口，蒙上黑布置于室溫條件下保濕培養，待到病葉上生長出新的白色霜霉層后，用消毒后的剪刀將帶有病斑的病葉剪下，得到離體的霜霉病菌。

最優的，所述沖洗掉表面殘留的霜霉病菌霉層過程使用的是無菌蒸餾水；所述紗布、濾紙、容器、棉花均經過消毒處理，達到無菌狀態；所述蒙上黑布置于室溫條件下保濕培養過程是置于20℃±2℃，濕度90％以上，黑暗的條件下保濕培養24～36h。

最優的，所述保存時間不超過120天；且最佳保存時間不超過90天。

一種葡萄霜霉病菌離體保存方法，將離體的葡萄霜霉病菌包埋在瓊脂粉中后置于低于-20℃的環境保存。

最優的，置于-80℃的環境保存。