[發(fā)明專利]一種S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810251630.4
• 申請(qǐng)日: 2018-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108456732A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李富榮;王勇;余濤;戴蘡瓔;衛(wèi)志堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市展行生物有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開(kāi)了一種S?poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法，包括如下步驟：初篩階段：將結(jié)直腸癌53例以及健康人87例分別混合為一份進(jìn)行篩選，利用S?poly(T)PCR技術(shù)，對(duì)已知血液中表達(dá)的485miRNA進(jìn)行檢測(cè)，分析篩選出存在顯著性異常表達(dá)的miRNA；復(fù)篩階段：將此前53例結(jié)直腸癌樣本按照TNM分期，將結(jié)直腸癌I?II期33例、結(jié)直腸癌III?IV期20例及健康人87例樣本分別混合成一份，利用S?poly(T)PCR技術(shù)，對(duì)第一步中篩選出差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，選出備選miRNA用于單個(gè)驗(yàn)證；驗(yàn)證階段：對(duì)48例結(jié)直腸癌、20例結(jié)直腸非癌性息肉、47例健康人血漿樣本進(jìn)行單個(gè)驗(yàn)證，分析各miRNA表達(dá)水平與病理分期、腫瘤大小、腫瘤位置等的相關(guān)性，評(píng)估m(xù)iRNA對(duì)結(jié)直腸癌的臨床診斷能力，本發(fā)明，檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單，實(shí)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法。

背景技術(shù)

結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率高居腫瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成為威脅我國(guó)公眾健康及生命的主要疾病之一，且目前有統(tǒng)計(jì)表明，近年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率仍呈逐步升高的趨勢(shì)，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的五年生存率不足13％，而早期結(jié)直腸癌五年生存率可達(dá)90％以上，但由于缺乏有效的早期診斷指標(biāo)和手段，其早期診斷率仍不足結(jié)直腸癌診斷的40％，大多數(shù)結(jié)直腸癌患者入院時(shí)已是晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療的黃金時(shí)期。

目前結(jié)直腸癌的診斷主要依靠結(jié)腸鏡檢查及活體組織病理檢查，但由于其花費(fèi)高并伴隨一定的檢查痛苦與風(fēng)險(xiǎn)以及由于檢查醫(yī)師技術(shù)問(wèn)題，如腸道準(zhǔn)備不全、退鏡速度過(guò)快等，存在一定漏診率，難以達(dá)到普查要求。CT、MRI等影像學(xué)檢查由于對(duì)結(jié)直腸微小病變難以做到早期診斷，并不足以滿足臨床要求。目前臨床常用的糞便隱血試驗(yàn)及腫瘤標(biāo)志物如CEA等，由于敏感性和特異性不足，不能有效的對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行篩查與早期診斷。尋找一種可用于結(jié)直腸癌早期診斷的花費(fèi)低、創(chuàng)傷小的新型腫瘤標(biāo)志物已成為一大熱點(diǎn)。越來(lái)越多研究證明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后等存在密切關(guān)系，有望成為臨床腫瘤的一種新型標(biāo)志物。

所以，如何設(shè)計(jì)一種S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法，成為我們當(dāng)前要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)已知血液中表達(dá)的485miRNA的方法，包括如下步驟：

1)初篩階段：將結(jié)直腸癌53例以及健康人87例分別混合為一份進(jìn)行篩選，利用S-poly(T)PCR技術(shù)，對(duì)已知血液中表達(dá)的485miRNA進(jìn)行檢測(cè)，分析篩選出存在顯著性異常表達(dá)的miRNA；

2)復(fù)篩階段：將此前53例結(jié)直腸癌樣本按照TNM分期，將結(jié)直腸癌I-II期33例、結(jié)直腸癌III-IV期20例及健康人87例樣本分別混合成一份，利用S-poly(T)PCR技術(shù)，對(duì)第一步中篩選出差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，選出備選miRNA用于單個(gè)驗(yàn)證；

3)驗(yàn)證階段：對(duì)48例結(jié)直腸癌、20例結(jié)直腸非癌性息肉、47例健康人血漿樣本進(jìn)行單個(gè)驗(yàn)證，分析各miRNA表達(dá)水平與病理分期、腫瘤大小、腫瘤位置等的相關(guān)性，評(píng)估m(xù)iRNA對(duì)結(jié)直腸癌的臨床診斷能力。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述初篩階段對(duì)本院收集的53例結(jié)直腸癌、87例健康人分別做血漿混合樣本，利用S-poly(T)PCR技術(shù)檢測(cè)485個(gè)miRNA，按照以下標(biāo)準(zhǔn)：FC(foldchange)>1或FC<-1、p<0.05，單個(gè)樣本Ct值<35，篩選出顯著差異的16種miRNA，其中2種miRNA上調(diào)，14種miRNA下調(diào)。