[發明專利]一種生物分子的電化學檢測方法

有效

• 申請號: 201810243420.0
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108445063B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 趙永祥;黃勇;鐘莉娉
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 韋肖燕

1.一種生物分子的電化學檢測方法，其特征在于，包括制備石墨烯/血紅素類過氧化酶復合納米材料、制備二茂鐵酪胺、制備適配體功能化復合材料、電極修飾和生物分子檢測；

所述制備石墨烯/血紅素類過氧化酶復合納米材料的步驟為：按質量比為1:15的比例分別稱取石墨烯和血紅素后，將石墨烯配置成石墨烯溶液，將血紅素配置成血紅素溶液，將兩份溶液混合后，加入NH₂-NH₂，渦旋10-15 min后，60-65℃水浴3-5 h，15000-20000 r/min離心25-35 min，所得沉淀用超純水洗滌，凍干，即得到石墨烯/血紅素類過氧化酶復合納米材料；

所述制備二茂鐵酪胺的步驟為：取二茂鐵甲酸于無水CH₂Cl₂溶解，0oC下緩緩滴加Et₃N，再依次加入HBTU和HOBt，0oC反應10-15 h，溶液由黃色變為紅色，旋轉蒸干，層析純化，得到紅褐色活化物，將其溶于THF后，取酪胺溶于硼酸緩沖溶液，0oC混合上述兩種溶液并調pH至9-10，反應8-10 h后，室溫反應20-24 h，旋轉蒸發除去THF，余下水相用EtOAc萃取一次后，將水相調pH至1-2，EtOAc再次萃取；將所得兩次萃取液合并，過濾、無水Na₂SO₄除水、再次過濾后旋轉蒸發，所得產物用展開劑溶解，柱層析進行純化，最后于35-40oC水浴鍋中干燥即可得到二茂鐵酪胺；

所述制備適配體功能化復合材料的步驟為：將石墨烯/血紅素類過氧化酶復合納米材料與核酸鏈P4混合均勻，超聲10-15min后室溫孵育24h，緩慢加入NaCl溶液；13000-15000r/min離心30-40min取上清，洗滌3次后，重新分散在Tris-EDTA緩沖液中，去除游離的適配體，即得適配體功能化復合材料；

所述電極修飾的步驟為：將巰基丙酸與核酸鏈P1滴到處理好的金電極表面，0-4oC自組裝10-12h，PBS洗滌3次，用EDC/NHS室溫活化30 min，PBS洗滌3次后，將電極浸泡在10 mM酪胺溶液30 min，用PBS洗滌3次，用1% BSA封閉非特異性位點，PBS洗滌3次，得修飾電極；

所述生物分子檢測的步驟為：將修飾電極表面滴加生物分子、生物識別分子及適配體功能化復合材料，35-37oC孵育1 -2h后，PBS洗滌3次，最后在電極表面滴加酪胺、二茂鐵酪胺、H₂O₂，50-55oC水浴30 min ，用PBS洗3次；以金電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在NaClO₄電解液中利用電化學工作站進行DPV掃描，掃描范圍-0.2~0.6V，掃描速率100-150 mV/s，通過電化學工作站檢測到的氧化還原電流的大小，即可實現對電化學檢測。

2.根據權利要求1所述的生物分子的電化學檢測方法，其特征在于，所述制備石墨烯/血紅素類過氧化酶復合納米材料的步驟中，所述石墨烯溶液配置方法為將石墨烯用適量超純水超聲分散均勻，3000 -4000r/min 10 -15min離心,取其上清液，即得；所述血紅素溶液配置方法為將血紅素用適量超純水分散均勻后,加入NH₃?H₂O，添加的超純水和NH₃?H₂O體積比為1000：5-20。

3.根據權利要求1所述的生物分子的電化學檢測方法，其特征在于，所述制備二茂鐵酪胺的步驟中，所述層析純化使用的試劑為二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇，其比例為二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇=9:3:1，所述的展開劑為二氯甲烷、甲醇，其比例為二氯甲烷:甲醇=10:1。

4.根據權利要求1所述的生物分子的電化學檢測方法，其特征在于，所述制備二茂鐵酪胺的步驟中，所述的酪胺溶于硼酸緩沖溶液的時間為12-14h，pH值為2-4。

5.根據權利要求1所述的生物分子的電化學檢測方法，其特征在于，所述制備適配體功能化復合材料的步驟中，加入NaCl溶液至終濃度10 mM。