[發明專利]一種檢驗檢疫蜂群中感染短膜蟲的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201810241647.1
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108251543A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 李繼蓮;吳杰;王劉豪;羅術東;黃家興;楊慧鵬;靳婷婷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種檢驗檢疫蜂群中感染短膜蟲的方法及試劑盒，涉及動物檢驗檢疫技術領域。本發明將待檢驗蜂樣品的腸道DNA，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示特異性引物序列進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，若能夠擴增出417bp的基因片段，則待檢驗蜂群中感染了短膜蟲。本發明的方法不僅可以檢測出感染宿主蜂的熊蜂短膜蟲，還可以鑒定出蜜蜂短膜蟲及其他種類的短膜蟲，擴大了檢驗檢疫對象的應用范圍。

技術領域

本發明涉及動物檢驗檢疫技術領域，特別是涉及一種準確、快速的診斷進出口熊蜂和蜜蜂上短膜蟲的方法。

背景技術

短膜蟲(Crithidia)屬于動鞭毛蟲綱(Zoomastigophorea)、動質目(Kinetoplastida)、錐蟲亞目(rrypanosomatina)、短膜蟲屬(Crithidia)。短膜蟲屬主要是無脊椎動物的寄生蟲，全部寄生于昆蟲，為昆蟲腸道寄生原蟲。寄生在蜂上的短膜蟲有熊蜂短膜蟲和蜜蜂短膜蟲，這些短膜蟲可交叉感染，國外研究報告熊蜂短膜蟲是危害熊蜂的腸道寄生蟲之一，據近期研究報道在智利外來進口熊蜂傳播熊蜂短膜蟲，造成當地的一種熊蜂種群數量減少的主要原因之一。隨著商品熊蜂群和蜜蜂群的應用規模越來越大，商品化蜂群在不同國家間的進出口也越來越頻繁，如果預防不好，不可避免會傳播一些病蟲害，其中寄生蟲是影響熊蜂和蜜蜂生態分布和商業化發展的主要因素之一，因此，短膜蟲成為熊蜂和蜜蜂進出口檢驗檢疫的重要病原物之一，但目前仍沒有一套完善的關于短膜蟲的檢驗鑒定方法。

短膜蟲感染的熊蜂和蜜蜂沒有任何明顯的外部癥狀，極易與微孢子蟲病混淆，但是其外部形態與微孢子蟲差別很大，短膜蟲活著狀態下在顯微鏡下可以看到其尾部有一條不停游動的小鞭毛。因此可以采用鏡檢法初步檢驗樣品是否被感染，鏡檢法是將被檢樣品研磨后，滴加蒸餾水，取1-2滴在載玻片上，于光學顯微鏡下觀察，但是鏡檢只能確定是否被感染短膜蟲，不能確定其是否是熊蜂短膜蟲，需采用分子方法進一步確定其種類。

現有技術中采用分子方法對寄生在熊蜂和蜜蜂身上的短膜蟲進行檢測鑒定，只能檢測鑒定出熊蜂短膜蟲，對于寄生在不同寄主上的蜜蜂短膜蟲以及其他種類的短膜蟲無法鑒定(Jilian Li,Haoran Qin,Jie Wu,Ben M.Sadd,Xiuhong Wang,Jay D.Evans,WenjunPeng,Yanping Chen.The prevalence of parasites and pathogens inAsian honeybeesApis cerana in China.Plos one)，而其他種類的短膜蟲也會感染蜜蜂或熊蜂。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種檢驗檢疫蜂群中感染短膜蟲的方法及試劑盒，不僅可以檢測出感染宿主蜂的熊蜂短膜蟲，還可以鑒定出蜜蜂短膜蟲及其他種類的短膜蟲。

為了解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：

一種檢驗檢疫蜂群中感染短膜蟲的方法，包括以下步驟：提取待檢驗蜂樣品的腸道DNA，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示特異性引物序列進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，若能夠擴增出417bp的基因片段，則待檢驗蜂群中感染了短膜蟲。

本發明中所述短膜蟲優選為熊蜂短膜蟲和蜜蜂短膜蟲。

優選的，所述PCR的反應體系優選為25μl反應體系，所述25μl PCR的反應體系中含有5μl Buffer，1.5μl 25mM的MgCl₂，2.0μl 200μM的dNTPs，10μM序列為SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的引物各1μl，0.625U/管的DNA聚合酶，5μl 5ng/μl的模板DNA，余量的ddH₂O。

優選的，所述PCR的反應條件為：95℃預變性4min后進入循環：95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，32個循環，最后72℃延伸10min。