[發(fā)明專利]一種針對(duì)于雄性基因的編輯方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810235823.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN108504690B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳子江;吳克良;趙涵;馬金龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陳子江;山東山大附屬生殖醫(yī)院有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/873
• 分類號(hào): C12N15/873;C12N15/90
• 代理公司: 北京邦信陽(yáng)專利商標(biāo)代理有限公司 11012
• 代理人: 陳悅軍

1.一種針對(duì)于雄性基因的編輯方法，包括以下步驟：

1)孤雄受精卵的獲得：制備僅含有單倍孤雄染色體的孤雄受精卵；

2)孤雄受精卵基因編輯：在原核期利用基因編輯技術(shù)對(duì)所述孤雄受精卵的目的基因進(jìn)行編輯；

3)編輯后孤雄胚胎卵裂球的分離：將步驟2)編輯后的孤雄受精卵進(jìn)行胚胎培養(yǎng)至具有卵裂球的時(shí)期，分離出其中一個(gè)卵裂球；

4)重構(gòu)孤雄胚胎：將步驟3)分離出來(lái)的卵裂球與MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)，得到重構(gòu)孤雄受精卵，將所述重構(gòu)孤雄受精卵繼續(xù)進(jìn)行胚胎培養(yǎng)至具有卵裂球的時(shí)期；

5)編輯結(jié)果的鑒定：取出步驟4)培養(yǎng)得到的一個(gè)卵裂球進(jìn)行編輯結(jié)果的鑒定，步驟4)得到的剩余卵裂球的基因組與用于鑒定的卵裂球的基因組完全一致；

所述方法用到的所有細(xì)胞和染色體均來(lái)源于非人類哺乳動(dòng)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中制備所述孤雄受精卵的方法包括以下a-f任一項(xiàng)所述的步驟：

a.將單精子注射到MII期卵母細(xì)胞使其激活受精，在原核期去除雌原核保留雄原核；

b.將孤雄單倍體細(xì)胞注射到MII期卵母細(xì)胞卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精，在原核期去除雌原核保留雄原核；

c.將MII期卵母細(xì)胞去除紡錘體后，用單精子注射使其激活受精；

d.將MII期卵母細(xì)胞去除紡錘體后，用孤雄單倍體細(xì)胞注射到其卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精；

e.將單精子注射到MII期卵母細(xì)胞使其激活受精，待其排出第二極體后將第二極體連同雌細(xì)胞核一同去除；

f.將孤雄單倍體細(xì)胞注射到MII期卵母細(xì)胞卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精，待其排出第二極體后將第二極體連同雌細(xì)胞核一同去除。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中所述基因編輯技術(shù)為鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶或CRISPR/Cas9技術(shù)；

所述編輯的方式為對(duì)所述目的基因進(jìn)行堿基修飾、堿基插入、堿基敲除和堿基替換中的一種或多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟3)和步驟4)中所述時(shí)期為2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、32細(xì)胞期、融合胚期、桑葚胚期或囊胚期。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟4)中所述重構(gòu)的方式為電融合、病毒融合和細(xì)胞注射中的一種或多種。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟4)中所述重構(gòu)孤雄受精卵的方法包括以下i-iii任一項(xiàng)所述的步驟：

i.將步驟3)分離出來(lái)的卵裂球注射到MII期卵母細(xì)胞卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精，在原核期去除雌原核保留雄原核；

ii.將MII期卵母細(xì)胞去除紡錘體后，用將步驟3)分離出來(lái)的卵裂球注射到其卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精；

iii將步驟3)分離出來(lái)的卵裂球注射到MII期卵母細(xì)胞卵周間隙，融合后再進(jìn)行激活受精，待其排出第二極體后將第二極體連同雌細(xì)胞核一同去除。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟5)中所述鑒定為鑒定基因編輯成功與否、編輯效果、細(xì)胞狀態(tài)、甲基化和轉(zhuǎn)錄組中的一種或多種。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：步驟5)之后還具有以下步驟：

6)編輯后細(xì)胞的應(yīng)用：將編輯成功的步驟4)培養(yǎng)得到的剩余卵裂球進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：步驟6)中所述后續(xù)應(yīng)用為重構(gòu)受精卵、重構(gòu)胚胎、建立胚胎干細(xì)胞系、基因功能的研究和細(xì)胞治療中的一種或多種。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述方法用到的細(xì)胞和染色體均來(lái)源于兔、大鼠或小鼠中的一種。