[發明專利]一種檢測自閉癥相關基因UBE3A拷貝數的試劑和方法

在審

• 申請號: 201810231311.7
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN110305948A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 楊旸
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;徐迅

本發明提供了一種檢測自閉癥相關基因UBE3A拷貝數的試劑和方法。具體地，本發明提供了一種檢測UBE3A拷貝數的引物和探針組合，以及利用該引物和探針進行檢測的方法，本發明還提供了包含該引物和探針的試劑盒。本發明特異性強、靈敏度高、簡便、快速，可作為自閉癥的分子診斷標記，同時為自閉癥靶向藥物的開發和應用提供重要的疾病分型依據。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，更具體地涉及一種檢測自閉癥相關基因UBE3A 拷貝數的試劑和方法。

背景技術

自閉癥譜系障礙是一種致病原因多樣化的廣泛性神經發育障礙型疾病，其 核心癥狀主要體現在社會交往、溝通能力的缺陷，局限重復性興趣、行為或活 動等方面。據美國疾控中心(CDC)2012年統計數字，新生兒的自閉癥發病率 已達到1/68，并且呈現逐年上升的趨勢。迄今為止，引起自閉癥的遺傳因素包 括基因點突變和染色體拷貝數變異，它們的突變涵括多種受累基因，涉及不同 的信號通路。在自閉癥病例中，母本染色體15q11-q13拷貝數的擴增大約占到 1-3％。其中在對多人群病例的研究中發現，UBE3A的過度激活是自閉癥亞型中 闡述最為清楚的致病因素。發明人目前的臨床前研究證實，UBE3A過度激活通 過負調控維甲酸RA信號通路來誘導自閉癥表型的發生。因此，對人UBE3A基因 拷貝數進行相對定量檢測，無論是對臨床自閉癥相關疾病的輔助診斷或是對新 生兒UBE3A基因相關的出生缺陷預防都是具有參考價值的指標之一。

拷貝數變異(Copy Number Variation，CNV)是基因組DNA發生的變異， 涉及的基因組序列長度從1kb到1Mb，包括拷貝數增加和拷貝數減少兩類。人是 二倍體生物，正常人細胞中2條同源染色體上各有一個正常的UBE3A基因，即每 個正常細胞有2份UBE3A基因。臨床表明UBE3A過度激活的自閉癥患者中，UBE3A 的拷貝數會超過正常2份，最常見的是3份和4份拷貝，甚至更多。因此鑒定與 自閉癥相關的UBE3A CNV信息對疾病的篩選、診斷、分型和對應的精準治療至 關重要，具有重大的應用價值。

目前臨床上尚無方便、可靠的針對UBE3A基因拷貝數相對定量的檢測方法。 臨床上檢測CNV的輔助檢測技術主要包括：1.比較基因組雜交芯片(aCGH)， 該技術是利用雜交芯片對未知樣品與對照樣品的基因組進行對比，此方法只適 合檢測Mb水平的CNV，而自閉癥中15q11-q13的小片段不能很好的檢出，此外該 技術操作繁瑣、耗時長、成本昂貴。2.多重連接探針擴增技術(MLPA)，該技 術利用多種引物探針與目的片段雜交，PCR擴增后使用毛細管電泳并相對定量， 此技術相對定量結果準備度高，質控體系完善，但操作復雜，耗時長(3天以 上)，整個流程需要開蓋3次，易造成樣品的污染，通量較低、成本較高、分 析繁瑣。無論是aCGH法還是MLPA法，雖然均可以對UBE3A基因組的拷貝數進行 相對定量，但均存在易污染、費時、費力、成本高的問題，并且拷貝數的相對 定量均為反應終點的半定量，結果判定更依賴經驗，而無法形成標準化的判定 方式。

近年來，已有研究人員將Realtime PCR技術應用于基因拷貝數檢測。 RealtimePCR即為基于實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術，主要分為SYBR Green和TaqMan兩種原理。TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連 接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同 時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅 基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒 光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增 一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完 全同步。TaqMan探針使該技術特異性非常高，結果可靠度高，操作簡單、使用 方便，樣本間污染可能性低，非常適合研究基因寡核苷酸多態性(SNP)和基 因拷貝數變異(CNV)。