[發(fā)明專利]一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810227542.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-20
• 公開（公告）號(hào): CN108410943A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙長(zhǎng)虹;朱新術(shù);解麗芹;張曉沛;王永學(xué);張其清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02;C12N5/077
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種MC3T3?E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法，將經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為病變骨組織的標(biāo)本置于含10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液的已消毒培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿四周事先鋪好冰塊，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)迅速移入內(nèi)含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的雙抗的PBS液中洗滌3次～5次；用組織剪剔除脂肪組織、壞死組織；用PBS液沖洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液浸泡等。本發(fā)明有助于闡明氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的作用，為抗骨質(zhì)疏松癥新藥的研制提供一定的理論依據(jù)。本測(cè)試方法簡(jiǎn)單、有效，便于實(shí)施。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：

骨質(zhì)疏松癥是老年常見的骨病，其特點(diǎn)是骨密度降低以及骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。隨著平均壽命的增加，骨質(zhì)疏松癥的患病率及其相關(guān)的并發(fā)癥如骨折的發(fā)生率在不久的未來(lái)都將進(jìn)一步的增加。老齡性骨質(zhì)疏松癥的診斷主要是通過(guò)骨骼的影像學(xué)檢查、骨密度檢測(cè)以及血液骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物的檢測(cè)。盡管現(xiàn)在針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療策略很多，但仍無(wú)法降低骨折的發(fā)生率。因此，發(fā)展新的診斷和治療策略是至關(guān)重要的。骨是一個(gè)基于持續(xù)的骨形成和骨吸收的穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)過(guò)程必須是平衡的，一旦失調(diào)就會(huì)產(chǎn)生病理性的結(jié)構(gòu)。以往，雌激素缺乏被認(rèn)為不僅是女性，而且還是男性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因。更年期卵巢功能的降低導(dǎo)致了骨量的丟失，同時(shí)雌激素的替代可以阻止這種情況的發(fā)生，所以，成年人骨量的丟失始于性激素水平的下降。然而，大型流行病學(xué)研究已經(jīng)清楚的證明，男性和女性的骨量丟失是發(fā)生在性激素改變之前，即在三十歲左右。因此，性激素缺乏并不能用來(lái)全面解釋骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。已有大量的證據(jù)表明隨著機(jī)體的老化，體內(nèi)增加的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)引起的氧化應(yīng)激可以影響骨的體內(nèi)平衡。發(fā)展新的治療手段的，需要了解ROS如何參與調(diào)節(jié)骨的生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)。大量研究證據(jù)表明，ROS特別是H2O2和一些超氧化物，參與了細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)通路，包括絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinas,MAPKs)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。ROS在促進(jìn)氧化應(yīng)激和疾病方面的有害影響近年來(lái)已引起高度關(guān)注。其中，氧化應(yīng)激和骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系是近年來(lái)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：

現(xiàn)有技術(shù)，不能有效測(cè)試出氧化應(yīng)激刺激能引起細(xì)胞的死亡，不能有助于解釋氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的作用，不能為抗骨質(zhì)疏松癥新藥的研制提供有效的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法，所述MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)試方法包括：

將經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為病變骨組織的標(biāo)本置于含10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液的已消毒培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿四周事先鋪好冰塊，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)迅速移入內(nèi)含青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的雙抗的PBS液中洗滌3次～5次；用組織剪剔除脂肪組織、壞死組織；用PBS液沖洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培養(yǎng)液浸泡；

使用眼科剪剪碎為0.5mm³大小的塊狀，使用0.15％胰酶消化分解切碎的樣本；通過(guò)無(wú)菌240目篩網(wǎng)過(guò)濾器過(guò)濾后將濾網(wǎng)表面的組織收集到一新100ml離心管內(nèi)，用離心機(jī)1500rpm×5分鐘分離細(xì)胞；清洗五次后1640培養(yǎng)液重懸而后加入10％～12％的胎牛血清6×10⁵細(xì)胞/毫升；最后MC3T3-E1細(xì)胞在5％～8％的CO₂ 37℃的環(huán)境下孵育培養(yǎng)；制成MC3T3-E1細(xì)胞懸液；